重组人促甲状腺激素α亚基在大肠杆菌中的表达

目的:构建pGEX-3X/hTSHα大肠杆菌表达系统,制备重组人促甲状腺激素α(TSHα)亚基。方法:Trizol法提取新鲜人绒毛膜组织总RNA,将1μg总RNA逆转录合成cDNA并以之为模板进行PCR扩增hTSHα亚基的完全编码序列。EcoRI和BamHI双酶切将所扩增的hTSHα基因定向克隆入表达载体pGEX-3X,转化感受态大肠杆菌Mach1-T1,IPTG诱导表达融合蛋白GST-rhTSHα。离心收集菌体,超声碎菌后获得包涵体。以梯度浓度降低的尿素溶液洗涤,8mol/L尿素溶液溶解包涵体。包涵体溶解液经透析后复性进行SDS-PAGE鉴定及竞争性ELISA抗原性分析。结果:DNA序列分析证实重组pGEX-3X/hTSHα质粒含有读码框正确的hTSHα基因。PAGE显示重组质粒可表达产生36ku大小的特异蛋白条带。ELISA结果表明,所表达的融合蛋白具有与抗人TSHα抗体相结合的能力。结论:成功构建了重组pGEX-3X/hTSHα表达载体,其产物具有hTSHα抗原性。

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达。方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pAO815中,并构建pAO815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性。结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pAO815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性。结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1600ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础。

组织工程自体骨修复兔大块骨缺损

目的:研究组织工程自体骨的植入对大块骨缺损修复的影响。方法:培养兔的自体原代骨髓间充质干细胞,制备壳聚糖-明胶网络/羟基磷灰石多孔材料-重组人BMP2(CS-Gel/HA-rhBMP-2)复合材料。将骨髓间充质干细胞作为种子细胞与CS-Gel/HA-rhBMP-2进行复合。截去兔桡骨中段7mm长度的骨组织,建立骨缺损动物实验模型。实验组(每只兔的右侧)植入CS-Gel/HA-rhBMP-2-种子细胞复合材料,对照组(每只兔的左侧)植入CS-Gel/HA材料,2组均不做内外固定,逐层缝合伤口。分别在术后第4、8和12周对缺损处进行X线评分和组织学评分。结果:术后第4周实验组X线和组织学评分与对照组相比差别无统计学意义,8周和12周实验组X线和组织学评分均优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:实验中所用移植修复材料具有优异的骨传导性、骨诱导性,可以缩短骨缺损的修复时间。

重组大鼠TSHα亚基在大肠杆菌中表达的实验研究

目的:通过构建重组大鼠TSHα链原核表达系统及表达产物的纯化工作,获得重组GST-rrTSHα融合蛋白,以备作为免疫原制备抗大鼠TSHα链的抗体。方法:提取大鼠垂体组织总RNA,RT-PCR扩增大鼠TSHα链编码序列,构建pGEX-3X/TSHα融合表达质粒转化入大肠杆菌中进行诱导表达。亲和层析纯化重组蛋白并以SDS-PAGE及Western Blot进行鉴定。结果:DNA序列分析表明重组pGEX-3X/TSHα质粒含有读码框正确的TSHα链编码序列,纯化产物的SDS-PAGE及Western Blot结果表明所获得的目的蛋白与预期分子量相符且可与抗GST抗体发生免疫识别。结论:成功获得重组GST-rrTSHα融合蛋白,为下一步的抗体制备奠定了基础。