非洲爪蟾孵化酶的cDNA结构及其部分生物化学特性的研究

以ＵＶＳ．２为探针从第２５期非洲爪蟾胚胎头背部的ｃＤＮＡ文库中筛选出了一个１８ｋｂ的孵化酶基因（ｘｈｅ），其转录产物最早出现于第１７期胚胎的头背部，在第３０期转录量达到高峰，随后便逐渐减少。该基因含有编码５１４个氨基酸的一个开框阅读框架，含有信号肽和原酶序列。所推测出的成熟蛋白有４２５个氨基酸，包括位于Ｎ端的含有２００个氨基酸的金属蛋白酶序列和位于Ｃ端的两个各１１０个氨基酸的ＣＵＢ重复区。而ＵＶＳ．２只代表该基因Ｃ端大约３／４的部分。同时还发现该酶分子量为６０ｋＤａ，是一种胰蛋白酶类型的金属蛋白酶。它很不稳定，在纯化过程中极易降解为４０ｋＤａ分子。６０ｋＤａ分子具有很强的卵黄膜溶解活性和蛋白酶活性。其中ＣＵＢ重复区很可能在介导卵黄膜和４０ｋＤａ分子中起着重要作用，而４０ｋＤａ分子很可能是在纯化操作过程中，由６０ｋＤａ分子发生降解或自身降解丢失了两个ＣＵＢ重复区而形成的，它只是６０ｋＤａ分子中的一个金属蛋白酶主功能区，所以它没有卵黄膜溶解活性，尽管仍具有很强的蛋白酶活性。

非洲爪蟾孵化酶分子对卵黄膜作用方式的研究

非洲爪蟾（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）的孵化液对卵黄膜和二甲基酪蛋白具有降解活性。用非洲爪蟾孵化酶的特异性抗ＧＳＴ－ＵＶＳ２抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交的结果表明，孵化液中出现一种分子量为６０ｋＤ的大组分，有时也会出现一种分子量为４０ｋＤ的小组分。含有大组分的酶样品具有很强的卵黄膜溶解活性，而只含有小组分的酶样品没有卵黄膜溶解活性，尽管二者具有几乎完全相同的蛋白酶活性。一系列卵黄膜溶解活性分析的结果表明，小组分孵化酶也参与了对ＶＥ的降解，但它对卵黄膜的成功溶解需要大组分孵化酶的协助。大组分孵化酶中的ＣＵＢ重复区对卵黄膜的分子结构具有识别或修饰作用，正是这种识别或修饰作用才使小组分孵化酶溶解卵黄膜成为可能。

蟾蜍细胞溶素的纯化及其生化特性研究

利用阴离子交换和凝胶过滤柱层析等方法对蟾蜍卵黄外被细胞溶素进行了分离纯化，获得了高纯度的样品．该酶的质量为３２ｋＤ，其特异性ＭＣＡ－人工合成底物为Ｂｏｃ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＭＣＡ，能被ＤＦＰ、ＳＢＴＩ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ和ｐ－ＡＭＰＳＦ等蛋白酶抑制剂所强烈抑制，但不受ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｅ－６４和ＥＤＴＡ等的影响。

蟾蜍(Bufo japonicus)细胞溶素基因筛选用探针的制备

利用阴离子交换、凝胶过滤和高压液相柱层析对细胞溶素基因进行了纯化，获得了纯度极高的酶样品．经ｌｙｓｉｌ 内肽酶进行定点酶切后，利用高压液相柱层析纯化出了该酶的多个短肽片段．其中，经测序获得了３ 个短肽片段的氨基酸序列．根据两栖动物中密码子的使用频率，可推测出其相应ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的核苷酸序列，进而制备出了３ 个ｃ Ｄ Ｎ Ａ 探针．利用这些合成的探针，便可从精子ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中筛选细胞溶素基因．