增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP在大肠杆菌中的表达与纯化

增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP/V16 3A/S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白 ,将mut4EGFP基因插入原核表达载体 pTWIN1中 ,使之与几丁质结合域 (CBD) 内含肽 (intein)融合 ,获得原核表达质粒 pTWIN M 4。将 pTWIN M 4转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS ,IPTG诱导后进行SDS PAGE电泳分析 ,结果显示 ,CBD intein mut4EGFP融合蛋白在BL2 1(DE3) plysS中获得高效表达并以可溶性蛋白的形式存在。进一步采用几丁质柱纯化系统对表达产物进行纯化 ,得到了高纯度的mut4EGFP。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK^-/gG^-/GP5^+的构建及其生物学特性初步探讨

以伪狂犬病毒基因缺失标志疫苗株TK-/gG-/LacZ+为亲本株,通过同源重组,构建了表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+。经PCR、Southern杂交、Westernblot证实构建正确,并能表达GP5。同时,对重组病毒在PK-15细胞中的增殖特性进行了检测,结果与亲本株相比,增殖滴度无显著性差异。将重组病毒免疫BALB/c小鼠,2次免疫后4周,50%(3/6)小鼠产生了低水平的GP5特异性ELISA抗体,但中和抗体均小于1:4。

猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)YA株为材料 ,采用RT -PCR扩增其ORF5基因全长cDNA并进行序列测定和比较分析。结果YA株ORF5基因cDNA编码区长 6 0 3bp ,可编码 2 0 0个氨基酸残基。与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株VR - 2 332株在氨基酸水平上的同源性分别为 5 8%和 90 % ,与国内首株分离株 (CH - 1a)的同源性高达 95 % ,推测YA株属于美洲型。根据YA株ORF5基因编码的氨基酸序列 ,与具有代表性的 12株美洲型毒株和 2株欧洲型毒株绘制进化系统树 ,结果也显示YA株与美洲型分离毒株的遗传关系较近 ,而与欧洲型毒株的遗传关系较远。进一步采用序列分析软件对推导的氨基酸进行比较分析 ,发现YA株ORF5编码的E蛋白存在 5个潜在的N -糖基化位点 ,6个抗原位点 ,其糖基化位点的数目及抗原位点的分布与其它美洲型毒株均存在一定程度的差异 ,但

修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的体液免疫

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) ORF5基因 DNA疫苗的免疫效力 ,将通用型辅助性 T淋巴细胞表位 (PADRE)插入 ORF5的中和表位和覆盖表位间 ,获得修饰后的 ORF5基因 ORF5 M。在此基础上 ,进一步构建了ORF5 M的真核表达质粒 p CI- 5 2 M。间接免疫荧光证实体外表达后 ,免疫 BAL B/c小鼠 ,检测免疫后的 EL ISA抗体和中和抗体 ,并与未经修饰的 ORF5基因真核表达质粒 p CI- 5 2进行比较。结果表明 ,修饰后的 DNA疫苗 p CI- 5 2 M诱导的 EL ISA抗体和中和抗体均明显优于未经修饰的 DNA疫苗 p CI- 5 2 ,是一种具有良好开发前景的

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达

对杆状病毒Bac to Bac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造 ,即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽 S 转移酶 (glutathione S transferase ,GST)基因 ,构建GST融合表达转座质粒pFGST。通过转座和转染Sf9细胞 ,证实该系统能高水平表达GST。采用PCR方法从pMT gp5 1质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)YA株ORF5基因 ,并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中 ,使之与GST融合 ,构建的重组转座质粒pFGST 5 3转染DH1 0Bac ,提取大分子BacmidDNA ,转染Sf9细胞 ,获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST5 3。rvGST5 3感染Sf9细胞 ,SDS PAGE和Western印迹分析表明 :与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达 ,表达产物分子量为 45kD ,能与抗PRRSVE蛋白单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物免疫小白鼠 ,经间接免疫荧光检测 ,免疫血清能使PRRSVYA株感染的MARC 1 45细胞呈较强的荧光着色 ,证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性。

含伪狂犬病毒完整UL49基因及部分UL48基因片段的克隆与序列分析

以地高辛标记的伪狂犬病毒 (PRV)Ea株UL4 9.5基因片段为探针 ,同SalI、KpnI、BamHI消化的PRVEa株基因组DNA进行Southern杂交 ,确定SalI 2 .8kb、KpnI 17.0kb、BamHI 2 5 .0kb片段中含UL4 9基因。将SalI2 .8kb片段克隆到pUC119中 ,利用其中的BamHI进行亚克隆 ,获得重组质粒pUC2 .0。测定约 2 .0kb片段的全序列并进行序列分析 ,发现该片段包含UL5 0基因部分编码区 ,UL4 9.5基因和UL4 9基因的完整编码区 ,并且在UL4 9基因下游 ,还存在一段约 36 9个碱基的序列 ,经与人单纯疱疹病毒I型 (HSV 1)、牛单纯疱疹病毒I型 (BHV 1)的UL4 8基因进行比对 ,具有较高的同源性 ,推测为PRVUL4 8基因的部分编码区。

伪狂犬病病毒Ea株UL14基因的克隆、序列分析及表达

从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中克隆含UL14基因的BamHⅠ第3片段并进行序列分析。根据测定的序列设计1对能扩增UL14基因完整编码区的引物,PCR扩增UL14基因并将其插入原核表达载体pGEX-KG,获得原核表达质粒pKG-UL14,转化BL21(DE3),在IPTG诱导下,GST-UL14融合蛋白获得高效表达,表达产物的相对分子质量为44 000,并以包涵体形式存在。纯化的表达产物免疫兔,获得了针对UL14蛋白的高效价多抗血清。进一步将UL14基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的3′端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL14,转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察发现,转染后24、48 h的融合蛋白EGFP-UL14主要定位在胞浆,但转染后72 h的融合蛋白主要定位在细胞核。上述研究结果为进一步阐明UL14的结构与功能奠定了基础。