2012年重庆市细菌耐药性监测

目的了解重庆市主要医院临床分离菌对常用抗菌药物的敏感性和耐药性。方法重庆市34所医院(包括一所儿童医院)临床分离菌采用MIC法及K-B法按统一方案进行细菌药物敏感试验,结果按CLSI 2012年版标准判断。结果 2012年1月至12月共收集重庆市临床分离菌共49636株,其中革兰阳性菌占26.6%,革兰阴性菌占73.4%。金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌中甲氧西林耐药株(MRSA和MRCNS)分别为26.9%和72.2%。葡萄球菌属中甲氧西林耐药株对β-内酰胺类抗生素和其他测试药的耐药率显著高于甲氧西林敏感株,未发现万古霉素和利奈唑胺耐药株。肠球菌属中粪肠球菌对多数测试药物的耐药率低于屎肠球菌,两者中均有少数万古霉素耐药株和利奈唑胺耐药株。非脑膜炎肺炎链球菌PISP和PRSP比例较高,未发现万古霉素耐药株。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中产ESBLs株分别为59.9%和30.9%。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素仍高度敏感,总耐药率小于1.0%。铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为20.2%和18.2%,鲍曼不动杆菌对两者的耐药率分别为52.1%和48.3%。多重耐药肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌增加明显。结论细菌耐药性严重,尤其是多重耐药菌对临床构成严重威胁。合理选用抗菌药,加强感染控制措施是当务之急。

细菌耐药监测网中WHONET软件数据处理步骤及分析注意事项

目的探寻细菌耐药监测网中WHONET软件数据处理步骤的合适方法。方法对上报至省级细菌耐药监测网的数据进行质量检查,然后用WHONET软件合并,之后进行修改以便WHONET软件识别进而进行分析,最后指出WHONET软件分析后的数据分析注意事项。结果上报至省级细菌耐药监测网的数据在WHONET软件分析前需要进行修改处理。结论成功探索出简便的细菌耐药监测网中WHONET软件数据处理步骤及处理后分析注意事项的方法。

2012年重症监护病房细菌耐药监测

目的了解2012年重症监护室病房(ICU)患者临床主要分离细菌的耐药性。方法采用自动化仪器法和纸片扩散法测定抗菌药物敏感性,参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2012年版判定标准判读结果,用WHONET5.6软件统计分析。结果 2012年共收集ICU病房非重复临床分离株1 374株,其中革兰阴性菌1 089株(79.3%),革兰阳性菌285株(20.7%);分离率排在前5位的细菌依次为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌;肠杆菌科细菌对亚胺培南和厄它培南出现耐药株;检出2株万古霉素耐药的屎肠球菌。结论该院ICU病房细菌来源以非发酵菌、肠杆菌科细菌、葡萄球菌属为主,耐药性比较严重,必须重视抗菌药物的合理使用,加强细菌耐药监测。

双特异抗体增效骨髓间充质干细胞干预心肌纤维化

目的:探讨在双特异抗体(Bispecificantibody,BiAb)的辅助下,骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)移植干预心肌纤维化的效果。方法:以anti-CD29(能识别间充质干细胞)和抗肌凝蛋白轻链抗体(Anti-myosin light chainantibody,AMLCA)(能特异性结合损伤心肌)制备BiAb(CD29×AMLCA)。将此BiAb与雄性小鼠BMSCs经尾静脉输入异丙肾性心肌纤维化雌性小鼠(BMSCs+BiAb组)。另设单纯BMSCs组、单纯BiAb组、正常对照组、未治疗组。5周后处死小鼠,荧光定量PCR检测心肌y染色体鉴别基因(Sex-determiningregion ofY-chromosome,SRY)、基质金属蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinas-es-9,MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表达。天狼猩红染色比较心脏胶原含量。结果:BMSCs+BiAb组的干细胞归巢数比BMSCs组多(P<0.05)。与未治疗组相比,BMSCs+BiAb组和单纯BMCSs组的心肌MMP-9和TIMP-1表达下调,心脏胶原沉积降低(P<0.05)。与BMSCs组相比,BMSCs+BiAb组的心肌纤维化改善更为明显(P<0.05)。结论:CD29×AMLCA双特异抗体可促进小鼠骨髓间充质干细胞的归巢。BMSCs归巢后能改善缺血心肌MMP-TIMP表达,干预心肌纤维化。

肺炎链球菌假想蛋白SPD0414的表达纯化及保守性分析

目的:获得纯化的肺炎链球菌(S.pn)重组假想蛋白SPD0414,并分析其在常见S.pn菌株中的保守性。方法:利用PCR方法扩增SPD0414蛋白胞外区核酸序列,将其克隆到原核表达载体ppSUMO内,转化到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白特异性及纯度。通过纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备其多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western blot方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在6种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果:克隆的SPD0414序列与Gene Bank中的数据相符,并实现了重组SPD0414蛋白高水平的可溶表达纯化蛋白免疫BALB/c小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western blot验证SPD0414蛋白在6株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论:成功制备了高滴度、高特异性的SPD0414多克隆抗体,证实了SPD0414在肺炎链球菌不同菌株间保守性较高,为肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。

2012年度某院患者无菌体液耐药性监测的调查

目的了解2012年度该院患者无菌体液的细菌分布和对抗菌药物的耐药性。方法对临床送检的无菌体液标本按常规进行病原菌分离,采用Vitek2-Compact系统和ATB Express系统进行鉴定,测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)值,采用纸片扩散法(K-B)进行微生物敏感性试验。应用WHONET 5.6软件进行数据分析。结果分离菌株556株,革兰阴性菌316株(57%),革兰阳性菌226株(40%)。常见细菌分别为大肠埃希菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的检出率分别为53.3%和21.1%;检出9株金黄色葡萄球菌,其中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(66%);耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(74%)。未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的葡萄球菌。未发现对万古霉素耐药的肠球菌属细菌。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类耐药的检出率分别为3.8%和3.8%。结论及时监测病原菌的菌群种类、分布和耐药变迁以指导临床合理、规范地使用抗菌药物。

重庆某医院近5年新生隐球菌感染患者临床资料及药物敏感性分析

目的了解重庆地区新生隐球菌感染的类型、治疗、预后和菌株耐药性情况。方法回顾性分析我院近5年新生隐球菌感染病例的临床资料以及6种抗真菌药物的敏感性。结果我院新生隐球菌感染共47例,感染类型以隐球菌性脑膜脑炎为主(72.3%),78.7%的患者为男性,且大部分患者无HIV感染;此外,有17.1%的患者患有隐球菌肺炎。37例患者进行血清和/或脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原检测,其阳性率均为100%。所有菌株对伊曲康唑和伏立康唑均为野生型,90%以上的菌株对5-氟胞嘧啶和泊沙康唑为野生型,对氟康唑为野生型的菌株占85.1%,但对两性霉素B为野生型的菌株仅有53.2%。经药物治疗后预后良好者占78.0%,但未进行治疗的患者中仅有16.7%预后良好。结论及时检测隐球菌荚膜多糖抗原有助于提高隐球菌感染诊断的阳性率,新生隐球菌培养阳性后及时进行药物敏感性试验非常重要,根据药敏结果尽早给予联合抗隐球菌治疗对改善患者预后意义重大。

2019株泌尿道分离细菌分布及耐药性分析

目的了解尿标本中临床分离菌的分布及耐药性。方法采用仪器法和纸片扩散法测定抗菌药物敏感性,参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)M100-S22文件标准判读结果,用WHONET5.6软件统计分析。结果 2012年尿标本非重复临床分离株2 019株。其中革兰阴性菌1 589株(占78.7%),革兰阳性菌430株(占21.3%);分离的菌株中以大肠埃希菌为主(占43.2%),其次为肠球菌属(占14.9%);约59%的菌株分离自女性患者,41%的菌株分离自男性患者;大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率分别为58.9%和52.6%。肠杆菌科细菌对亚胺培南和厄它培南出现耐药株,阴沟肠杆菌对亚胺培南和厄他培南的耐药率分别达14.1%和40%。检出三株万古霉素耐药的屎肠球菌(占2.3%)。结论尿标本的主要分离菌为大肠埃希菌,其次肠球菌属细菌和肺炎克雷伯菌。阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药率呈明显升高趋势。

血清和支气管肺泡灌洗液GM试验对非粒细胞缺乏患者不同类型肺曲霉病的诊断价值分析

目的探讨血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)GM试验在不同类型肺曲霉病中的诊断价值,并确定BALF GM试验对常见肺曲霉病的最优cut-off值。方法收集2017年1月至2021年3月在重庆医科大学附属第一医院诊断为肺曲霉病且同时送检过血清和BALF GM试验的非粒细胞缺乏患者资料146例,其中侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)97例,慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis,CPA)39例,变应性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)10例;并随机选取132例同时期患有其他类型肺部疾病者作为对照组。统计分析血清和BALF GM试验对不同类型肺曲霉病的诊断性能。结果在非粒细胞缺乏患者中,BALF GM试验对IPA和CPA诊断的最优cut-off值分别为1.0和0.91,敏感性分别为74.2%和74.4%,特异性分别为83.3%和81.1%,但对ABPA的诊断作用有限(AUC=0.648);在cut-off值为0.5时,血清GM试验对IPA和CPA的诊断敏感性分别为41.2%和10.3%,对ABPA的诊断价值较差(AUC<0.5)。结论在非粒细胞缺乏患者中,BALF GM试验对IPA和CPA的诊断均有良好辅助诊断作用,但对ABPA的诊断作用有限;血清GM试验对IPA和CPA的诊断敏感性较低,对ABPA的诊断价值更差。

(1,3)-β-D-葡聚糖检测对侵袭性真菌感染临床价值的再评价

目的探讨（1,3）-β-D-葡聚糖检测（G试验）在侵袭性真菌病诊断中的价值。方法回顾性研究重庆医科大学附属第一医院2014年1~6月间临床G试验的住院患者结果,分析G试验诊断真菌感染的敏感性、特异性、符合率、阳性预测值、阴性预测值、约登指数等能力指标。结果真菌感染组G试验检测值228.4±250.1pg/mL,非真菌感染组G试验检测值32.6±13.6pg/mL,两组间有显著统计学差异（P〈0.001）;G试验对真菌感染的敏感性、特异性、符合率、阳性预测值、阴性预测值、约登指数分别为83%、92%、88%、89%、87%、0.75。结论 G试验是真菌感染的重要早期实验室指标之一,对其合理应用可有效提高真菌感染的诊治水平,特别是阴性结果对排除真菌感染的意义更大。

长链非编码RNA UCA1通过靶向调控miR-613进而调控乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨尿路上皮癌胚抗原(UCA)1对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及潜在的作用机制。方法运用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测人乳腺上皮细胞株HBL-100和人乳腺癌细胞MDA-MB-231中UCA1和miR-613的表达水平;将si-con组(空转染)、si-UCA1组(转染si-UCA1)、miR-con组(转染miR-con)、miR-613组(转染miR-613 mimics)、pcDNA组(空转染)、pcDNA-UCA1组(转染UCA1过表达载体)、WT-UCA1+miR-con组(共转染WT-UCA1和miR-con)、WT-UCA1+miR-613组(共转染WT-UCA1和miR-613 mimics)、MUT-UCA1+miR-con组(共转染MUT-UCA1和miR-con)、MUT-UCA1+miR-613组(共转染MUT-UCA1和miR-613 mimics)、si-UCA1+anti-miR-con组(共转染si-UCA1和anti-miR-con)和si-UCA1+anti-miR-613组(共转染si-UCA1和anti-miR-613),均用脂质体法转染至MDA-MB-231细胞;采用MTT法检测各组细胞增殖;Transwell检测各组细胞迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果乳腺癌MDA-MB-231细胞于乳腺上皮HBL-100细胞,UCA1的表达水平显著升高,miR-613的表达水平显著降低(P<0.05);抑制表达UCA1、过表达miR-613均可抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭;UCA1可靶向调控miR-613的表达。miR-613抑制表达可部分逆转抑制UCA1表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论长链非编码RNA UCA1可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与靶向miR-613基因有关,将可为乳腺癌的预防和治疗提供新靶点。

2015—2017年某三级医院呼吸内科细菌耐药性监测

目的了解三级医院呼吸内科分离菌对常用抗菌药物的耐药性。方法临床分离菌采用MIC法按统一方案进行细菌药物敏感试验,结果按临床实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2017年版标准判断。结果 2015年1月—2017年12月收集呼吸内科临床分离菌共1428株,其中革兰阳性菌占22.3%,革兰阴性菌占77.7%。金黄色葡萄球菌中甲氧西林耐药株(MRSA)为29.7%。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中产ESBLs株分别为52.6%和33.1%。流感嗜血杆菌对复方磺胺甲噁唑耐药率高达81.3%。铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为25.7%和14.0%,鲍曼不动杆菌对两者的耐药率均是73.0%。结论呼吸内科细菌耐药性严重,尤其是多重耐药菌对临床构成严重威胁。合理选用抗菌药物,加强感染控制措施是当务之急。

抑癌基因maspin在胃癌细胞株SGC-7901中的表达及意义

目的探讨抑癌基因maspin在胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡过程中的生物学作用。方法构建重组质粒pCD-NA3.1-maspin,转染胃癌细胞株SGC-7901,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测maspin基因表达,MTT法检测细胞增殖,原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果重组质粒pCDNA3.1-maspin导入SGC-7901细胞株后,maspin的mRNA和蛋白表达明显增强(P<0.05),胃癌细胞株SGC-7901增殖受到抑制,并出现明显的细胞凋亡。结论 maspin基因可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,并诱导细胞凋亡。

重组肺炎链球菌甘油脱氢酶活性及晶体培养的初步分析

甘油脱氢酶能够氧化胞内甘油为代谢活动提供能量,并参与调控宿主粘附相关细菌蛋白质的表达,是潜在的抗菌药物靶点.本文利用大肠杆菌BL21原核表达肺炎链球菌甘油脱氢酶,获得大量上清表达的目的蛋白.再用Ni-NAT-Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析以及Superdex 200分子筛进行纯化.经数据拟合,证实该酶在溶液中以同源二聚体形式存在.光谱实验证实,该重组表达甘油脱氢酶仍具有氧化甘油生成1,3-二羟基丙酮的活性.用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体,在0.1 mol/L Bicine pH 9.6,13%PEG MME 5000,0.2 mol/L KSCN,4%Dioxone条件下,得到了晶型好且有一定衍射能力的单晶,为解析肺炎链球菌甘油脱氢酶的三维结构及研究结构与酶活之间的关系奠定了基础.

分化抑制因子1在乙型肝炎病毒复制、肝癌细胞增殖和凋亡中的作用及机制研究

目的探讨分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1,Id1)在乙型肝炎病毒复制、肝癌细胞增殖和凋亡中的作用及机制。方法使用RNA干扰技术将HepG2.2.15肝癌细胞株的Id1基因沉默,作为siRNA-Id1组;设计无关序列作为siRNA-Control组;使用Pifithrin-α抑制siRNA-Id1细胞中p53的表达,作为siRNA-Id1+Pifithrin-α组;将HepG2.2.15肝癌细胞作为Control组。依次使用qRT-PCR、Western blot、ELISA、MTT、流式细胞术检测乙型肝炎病毒的复制、细胞的增殖和凋亡。结果siRNA-Id1组细胞中Id1 mRNA和蛋白的表达量低于siRNA-Control组(P<0.05)。与siRNA-Control组相比较,siRNA-Id1组细胞中HBx mRNA和蛋白的表达量降低(P<0.05),上清液中HBs Ag和HBeAg的含量降低(P<0.05),细胞增殖缓慢(P<0.05),早期细胞凋亡比例和晚期细胞凋亡比例升高(P<0.05),细胞中Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达量升高(P<0.05),而Bc L-2蛋白的表达量降低(P<0.05)。Pifithrin-α可不同程度的抑制Id1基因沉默后的上述生物学效应(P<0.05)。结论RNA干扰Id1可以降低乙型肝炎病毒的复制,抑制肝癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与p53的过表达有关。

GRP78单抗多抗的制备鉴定及其免疫学检测方法的建立

目的:制备与鉴定抗GRP78兔多克隆抗体与腹水型单克隆抗体,进一步建立可检测GRP78蛋白的双抗夹心ELISA方法。方法:利用课题组前期已经成功构建的pW28-GRP78重组质粒,IPTG诱导表达后经过Ni2+-NTA亲和层析柱分离纯化获得高纯度GRP78重组蛋白;获得的GRP78蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,辛酸-硫酸铵沉淀后DEAE离子交换层析法纯化;制备GRP78腹水型单克隆抗体并鉴定其亚型,Protein G亲合柱纯化;采用Western blot、免疫荧光、免疫组化等方法对获得的GRP78兔多抗与鼠单抗进行鉴定;建立一个可检测GRP78蛋白的双抗夹心ELISA免疫学方法。结果:高效获得高纯度GRP78重组蛋白,成功制备兔多抗,同时获取8株腹水型单克隆抗体,选择效价最高的McAb-1用于后续双抗夹心ELISA实验,McAb-1为G2a型;进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性;单抗作为捕获抗体,多抗作为检测抗体,HRP标记的羊抗兔酶标二抗,成功建立可检测人GRP78的双抗夹心ELISA方法,检测下限为152.3 ng/mL。结论:成功获取了高效价、高灵敏度及高特异性的GRP78兔多抗及腹水型鼠单抗,并在此基础上建立了可检测人GRP78蛋白的双抗体夹心ELISA检测系统,为GRP78的进一步研究奠定重要基础,具有良好的临床应用前景。

maspin诱导不同分化的胃癌细胞凋亡及可能的作用机制

目的探讨maspin诱导胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45凋亡的作用及可能的作用机制。方法重组质粒pCD-NA3.1-maspin分别转染胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Westernblotting)检测maspin基因表达,末端标记细胞凋亡法(TUNEL)检测细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的改变。结果重组质粒pCDNA3.1-maspin导入SGC-7901和MKN-45细胞株后,maspin的mRNA和蛋白表达均明显增强(P<0.05),两种细胞均出现明显的细胞凋亡,且两种细胞中的Bax蛋白均上调,而Bcl-2蛋白均下调。结论 maspin基因可能通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白诱导胃癌细胞凋亡。

人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定

目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的 rhNGAL 抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G 亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争 ELISA 法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE 分析纯度;最后运用 Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果:高效获得高纯度 NGAL 重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得 6 株高效价单克隆抗体;其中,25 号单抗为 IgG1 亚型,余者均属 IgG2a 亚型,且 19、35 号单抗的亲和常数分别为 3.06×10^9、2.14×10^9。SDS-PAGE 分析表明纯度均大于 90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论:本研究利用密码子优化技术高效表达制备了 NGAL 重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为 NGAL 的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。

分化抑制因子1重组腺病毒的构建及其动物模型的建立

目的:构建分化抑制因子-1(inhibitor 1 of differentiation,Id1)重组腺病毒(recombinant adenovirus,Rad),并建立Id1过表达的小鼠动物模型。方法:在HEK293细胞中将腺病毒重组质粒Ad Easy-Id1进行包装以获得Id1重组腺病毒(RAd-Id1);通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记法测定腺病毒滴度;通过q RT-PCR和Western blot验证RAd-Id1感染的Hep G2细胞中的Id1过表达效果,用MTS比色法检测RAd-Id1对Hep G2细胞增殖的影响;通过尾静脉注射RAd-Id1的感染方式建立肝组织中过表达Id1的小鼠动物模型,病毒载量梯度实验分PBS空白组、RAd-GFP对照组及RAd-Id1实验组(n=5/组)以测定RAd-Id1感染小鼠的适合载量;病毒感染时间梯度实验每5 d检测1次为1组,共7组(n=5/组)以测定感染小鼠的适合时间;通过Western blot检测小鼠肝组织中Id1的过表达效果及甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的表达水平,再采用ELISA检测小鼠血清中Id1的免疫原性及AFP和CEA的表达情况。结果:成功包装获得RAdId1,测得其滴度为1.5×1011 GFU/m L;RAd-Id1感染Hep G2细胞48 h和72 h后,Id1的转录和蛋白水平均明显升高(P<0.01);96 h时RAd-Id1实验组的MTS检测值较PBS空白组和RAd-GFP对照组(2.00±0.06 vs.1.18±0.05,2.00±0.06 vs.1.10±0.07;F=51.350,P=0.000)明显升高;Western blot结果显示:在RAd-Id1感染的小鼠肝组织中,Id1、AFP和CEA蛋白水平较PBS空白组和RAd-GFP对照组升高;ELISA实验结果表明:血清中AFP和CEA蛋白水平与RAd-Id1的载量呈正相关(rs AFP=0.903,PAFP=0.014;rs CEA=0.964,PCEA=0.002),不同载量RAd-Id1感染小鼠的血清中Id1抗体滴度无显著差异(P>0.05)。结论:成功构建了RAdId1及其介导的小鼠动物模型;RAd-Id1可作为细胞水平上研究Id1对肝癌影响的载体工具;AFP和CEA的升高提示Id1可能参与诱导AFP和CEA的表达。

葡萄糖调节蛋白GRP78与HBV的PreS1相互作用位点的初步研究

目的:初步研究78 k D的葡萄糖调节蛋白(the 78 k D glucose-regulated protein,GRP78)与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的前S1蛋白(Pre S1)的相互作用位点。方法:利用PCR技术扩增GRP78的基因,将扩增的目的基因克隆至p W28载体质粒,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)B834中表达,经过镍离子亲和层析柱纯化GRP78蛋白;将Pre S1 3个截短片段的重组质粒(p GST-Pre S1-X1/X2/X3)在B834中表达后,经过GST亲和层析柱纯化相应蛋白;利用蛋白质体外结合实验(pull down)、微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)检测GRP78与Pre S1 3个截短片段的相互作用。结果:成功构建重组质粒p W28-GRP78;获得GRP78蛋白及Pre S1 3个截短片段的融合蛋白;pull down及MST实验验证了GRP78可以与Pre S1的3个片段结合,且GRP78与GST-Pre S1-X1结合效果最好。结论:利用分子克隆技术及蛋白质表达纯化技术,获得GRP78蛋白及Pre S1截短片段的融合蛋白,并初步筛选了Pre S1与GRP78的相互作用位点,为后续研究打基础。