大鼠抗人β-catenin多克隆抗体的制备与鉴定

目的:原核表达和分离纯化人β-catenin(138-781 aa)蛋白并制备特异性大鼠抗人β-catenin多克隆抗体。方法:利用PCR扩增β-catenin基因片段并克隆至pET-30a(+)表达载体构建重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中,经原核表达优化后,诱导β-catenin蛋白表达,以SDS-PAGE和Western blot实验进行鉴定。采用亲和层析方法分离纯化β-catenin蛋白,以荧光偏振实验进行生物学活性鉴定。用β-catenin蛋白为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,随后采用ELISA和Western blot实验检测多克隆抗体的效价和抗原特异性。结果:成功进行了β-catenin蛋白的原核表达与分离纯化。荧光偏振实验表明纯化的β-catenin蛋白具有良好的生物学活性。ELISA实验表明抗人β-catenin多克隆抗体效价可达1∶128 000。Western blot实验证实抗人β-catenin多克隆抗体具有良好的抗原特异性。结论:成功进行了大鼠抗人β-catenin多克隆抗体的制备与鉴定,为深入研究β-catenin的生物学功能奠定了实验基础。

重组人β-catenin原核表达条件的优化及生物学活性鉴定

优化重组人β-catenin(138~686 aa)在大肠埃希菌中的原核表达条件,经分离纯化后进行生物学活性鉴定。利用基因工程技术,将构建的重组质粒β-catenin-pET-30a(+)转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后进行β-catenin原核表达。为了提高β-catenin表达量,从诱导时间、诱导温度与IPTG诱导浓度3个单因素方面进行原核表达条件优化。β-catenin经HisTrap层析柱分离纯化后,以荧光偏振实验和酶联免疫吸附测定实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行生物学活性鉴定。构建的工程菌经原核表达条件优化后,确定诱导温度25℃、诱导时间10 h、0.2 mmol/L IPTG作为β-catenin最佳原核表达条件。荧光偏振实验和ELISA实验说明,纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。本研究成功进行了重组人β-catenin原核表达条件的优化与生物学活性鉴定,为深入研究β-catenin在肿瘤免疫抵抗中的生物学功能奠定了实验基础。

大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)原核表达、纯化与大鼠多克隆抗体的制备

目的制备大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)第185至328位氨基酸功能蛋白及其特异性大鼠多克隆抗体。方法以基因合成法合成Ec-ZipA第185至328位氨基酸功能蛋白的基因序列,利用DNA重组技术与p ET-30a(+)载体连接构建重组质粒。将重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中进行Ec-Zip A原核表达与表达优化。采用亲和层析方法分离纯化Ec-Zip A后,以荧光偏振(FP)实验进行生物学活性鉴定。以重组Ec-Zip A为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法检测抗体滴度和抗原特异性。结果 SDS-PAGE分析和Western blot实验证实大肠杆菌成功表达Ec-Zip A蛋白。FP实验表明纯化的Ec-Zip A具有良好的生物学活性。ELISA结果表明多克隆抗体具有较高的抗体滴度,效价可达1∶512 000。Western blot实验证实多克隆抗体具有良好的抗原特异性。结论成功进行了Ec-Zip A原核表达、分离纯化并制备了大鼠抗Ec-Zip A多克隆抗体。

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型的建立与应用

基于荧光偏振(fluorescence polarization, FP)原理,建立并应用以β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4)相互作用为靶标的小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型获得苗头化合物。利用大肠杆菌原核表达系统,原核表达和分离纯化重组人β-catenin,以酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行生物学活性鉴定。以异硫氰酸荧光素(fluorescence isothiocyanate, FITC)标记的TCF4多肽为荧光探针,通过优化FITC-TCF4与β-catenin反应浓度,建立并应用靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型进行苗头化合物筛选。利用大肠杆菌原核表达系统成功进行了重组人β-catenin原核表达与分离纯化。ELISA实验证实了纯化的重组人β-catenin具有良好的生物学活性。选用20 nmol·L^-1FITC-TCF4和100 nmol·L^-1β-catenin,成功建立了Z’因子为0.88的荧光偏振高通量筛选模型。应用本筛选模型进行高通量筛选,成功筛选到了血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)和化合物S720具有良好的抑制活性。本研究成功建立了适用于靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型,为新型Wnt抑制剂的高效化和理性化发现奠定了基础。

大肠杆菌Fts Z蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为制备特异性抗大肠杆菌丝状热敏蛋白Z(Escherichia coli filamentous thermosensitive protein Z,Ec-FtsZ)多克隆抗体,将Ec-FtsZ基因进行化学合成后连接pET-22b(+)表达载体,构建重组质粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)。将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行Ec-FtsZ原核表达与表达条件优化,以HisTrap层析柱进行Ec-FtsZ的分离纯化,再以孔雀绿法进行Ec-FtsZ GTPase(Guanosine triphosphatase)活性测定。使用纯化的Ec-FtsZ为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、Western blotting实验和免疫荧光实验鉴定,抗Ec-FtsZ多克隆抗体效价可达1∶256 000且具有良好的抗原特异性。抗Ec-FtsZ多克隆抗体的成功制备为Ec-FtsZ生物学功能研究和生化检测奠定了实验基础。

基于β-catenin/Lef1相互作用为靶标的新型抗肿瘤药物高通量筛选模型的建立

旨在以β-catenin/Lef1相互作用为靶标,建立基于ELISA原理的适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。利用DNA重组技术,将构建的β-catenin-pET-30a(+)重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3),经诱导培养后进行β-catenin原核表达。采用亲和层析方法分离纯化β-catenin后,以GSTPulldown实验进行生物学活性鉴定。利用ELISA原理建立β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,通过优选GST-Lef1最佳包被浓度和β-catenin最佳反应浓度,建立适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。SDS-PAGE和Western blotting实验证实β-catenin的原核表达。GST Pulldown实验证实纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。通过对基于ELISA原理建立的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型优化,选用10μg/mL GST-Lef1和6μg/mLβ-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z?因子为0.76。本研究成功建立了基于ELISA原理的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,为靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂的高通量筛选奠定了基础。