绵羊miR-1基因前体序列的多态性分析

为了检测不同产肉性能的绵羊群体中miR-1基因前体序列的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP),并与绵羊骨骼肌发育进行相关性分析,采用不对称聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对萨福克羊和湖羊2种产肉性能不同绵羊的miR-1基因前体序列进行SNP检测,并预测该SNP位点对miR-1前体序列二级结构稳定性所造成的影响。结果表明,在绵羊miR-1基因前体成熟序列的下游115 bp处检测到1个A→G突变,并且该SNP位点与绵羊的产肉性能有一定的相关性;由国外引进的优良肉羊品种萨福克羊,GG基因型为其优势基因型,G等位基因频率为0. 76;通过miR-1基因前体序列二级结构预测发现,该SNP位点能够使其发生变化,使ΔG降低1. 5 kJ/mol。综上所述,绵羊miR-1基因前体序列的SNP位点可能对miR-1前体的加工成熟产生重要影响,最终影响绵羊的产肉性能。

抗B组柯萨奇病毒3型3C蛋白多克隆抗体的制备及初步应用

目的制备抗B组柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB)3C蛋白的多克隆抗体。方法通过聚合酶链式反应从pcDNA3.1(+)-EGFP-3C中扩增编码3C的DNA片段,构建pET28a(+)-3C-6His表达载体,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli,E.Coli)BL21(DE3)以表达3C重组蛋白。优化表达条件及菌体蛋白的提取方法,经超声破碎制备菌体总蛋白,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,用氯化钾进行胶染色,切胶回收相对分子质量为26000的蛋白,即纯化的3C重组蛋白(3C-6His的相对分子质量为26000)。用纯化的1 mg 3C重组蛋白加等量弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,共免疫5次,每次间隔1周,免疫结束后1周取兔血清,检测抗体的特异性。结果在相对分子质量为26000的位置检测到了3C-6His融合蛋白的表达,成功构建了高效表达带His标签的3C重组蛋白载体。重组3C蛋白原核优化表达条件为37℃培养细菌6 h,加0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导。经SDS-PAGE分离菌体总蛋白,得到了纯化的3C重组蛋白。获得的兔免疫血清可以结合E.Coli及HeLa细胞表达的3C蛋白,还能识别感染CVB3或肠道病毒A71的HeLa细胞中表达的3C蛋白。结论获得了抗CVB33C蛋白酶的多克隆抗体,这一抗体可特异结合肠道病毒的3C蛋白酶,为进一步研究3C蛋白酶在肠道病毒致病机制中的作用奠定了基础。