微卫星锚定PCR研究湖北钉螺的遗传变异

目的 对中国不同自然隔离群的湖北钉螺进行遗传变异研究 ,并为其种及种下分类提供依据。 方法 采用微卫星锚定 PCR(SSR- PCR)技术对中国 7省 15地湖北钉螺基因组 DNA进行 PCR扩增 ,根据扩增产物 ,计算遗传距离(D) ,并构建系统进化树。 结果 各地域标本 PCR扩增产物均呈多态性 ,其中中国大陆与中国台湾湖北钉螺之间的遗传距离为 0 .35 1± 0 .0 4 8(0 .2 6 3～ 0 .4 4 5 ) ;中国大陆湖北钉螺山区型之间的遗传距离为 0 .0 4 3;湖区型之间的遗传距离为0 .0 0 0～ 0 .2 17;山区型与湖区型之间的遗传距离为 0 .182～ 0 .30 8;来自湖北省境内 9个地域的湖北钉螺 ,其遗传距离为0 .0 0 0～ 0 .16 7。 结论 根据所采集的湖北钉螺标本和 SSR- PCR的实验结果 ,认为中国大陆湖北钉螺在基因分类水平上至少可分为不同层次的 4类 :1云南洱源、四川天全为一类 ;2安徽贵池、湖南岳阳、湖北荆门、江西新建为一类 ;3湖北武汉、湖北钟祥、湖北阳新、湖北松滋、湖北沙市、湖北石首、湖北应城为一类 ;4湖北赤壁单独为一类。其中 1与 2 34在总体上可分为两大类 ,2 34又可再分为 2 3与 4两类 ,2 3还可再分为单独的两类。此外 ,台湾钉螺为单独的一类。

PCR检测鉴别我国5个旋毛虫地域株的研究

为明确我国不同地域株旋毛虫分子分类概况，采用扩增长度片断多态性（AFLP）对来源于云南、湖北、西安、天津、黑龙江5个地区的旋毛虫株作PCR研究。使用引物为P1株旋毛虫1．6kbDNA重复序列，质粒pPRA设计的A1、B1，模板DNA酚、氯仿、异成醇抽提和粗提DNA两种，经反复多次扩增，1．5％琼脂糖凝胶电泳。5个地域株均获得稳定的500hP条带，湖北与天津株还获得非稳定的670hP条带。与国外文献报道比较，中国大陆各地域株旋毛虫与欧洲各株旋毛虫有明显差异，与香港株相近。大陆各地的地域株之间差异不明显，仅见湖北、天津株与其它3个地域株有不稳定的差异。

用DIFA检测肿瘤患者的弓形虫抗体

目的 :为了解湖北肿瘤患者弓形虫感染概况并探索新技术直接免疫固相凝集试验( DIFA)等 3项试验联合筛选诊断弓形虫感染的意义。方法 :使用 DIFA检测 10 0例肿瘤患者的弓形虫 Ig G抗体 ,阳性者用 Ig G- IFAT复查 ,再用 Toxo- Ig G/ Ig A/ Ig M- ISAGA检测。结果 :DIFA检测阳性率为 12 % ( 12 / 10 0 ) ,Ig G- IFAT检测符合率为 10 0 % ;Ig A可疑 1例 ;Ig M抗体阳性 4例 ,可疑 1例 ,其中 2例提示为活动性感染。合并弓形虫感染的 12例分布于肺癌、非何杰金氏淋巴瘤和乳腺癌患者中 ,其感染率分别为受检人数的 2 2 .2 % ( 6/ 2 7)、19.3% ( 5/ 2 6)及 7.1% ( 1/ 14)。结论 :DI-FA的敏感性和特异性均较佳 ,3种方法的联合应用适宜作弓形虫感染的常规筛选诊断。提示免疫功能降低的肿瘤患者 ,特别是肺癌和非何杰金氏淋巴瘤患者容易感染弓形虫病或促使潜伏的弓形虫病活动。

几种弓形虫ELISA试剂盒初步检测结果比较

本文选用 5种国内弓形虫 EL ISA试剂盒检测已知同样样品 ,并且用国外试剂盒核查由该 5种试剂盒提供的阳性样品 ,作试剂盒质量比较。结果 Ig G- EL ISA试剂 A、B盒阳性检出率 (敏感性 )均为 6 0 % ,A、B盒之间的符合率仅为5 0 % ,其特异性分别为 35 %和 90 % ;C、D、E阳性检出率 (敏感性 )分别为 30 %、6 0 %、70 % ,特异性分别为 75 %、5 4%、87%。核查 A、B、D、E盒提供的样品结果 :Ig G符合率较好 ,均在 90 %以上。 Ig M符合率均为 6 0 %。鉴于目前国内 EL ISA试剂盒的现状 ,本文分析后建议 ,除改进质量外 ,宜选择多种试剂盒联合应用 ,避免漏检和误诊。

应用DIFA等三项试验联合筛选孕妇弓形虫感染的研究

用DIFA初筛检测197例武汉地区非选择性孕妇，其弓形虫抗体阳性率为8．12％（16／197）；阳性者用IFT—IgG复查，阳性符合率为93．75％，即阳性率为7.61％（15／197），15例阳性者的滴度分别为1：164例，1:649例，≥1：10242例；DIFA阳性者还用Toxo－IgG／IgA／IgM－ISAGA检测，有2例IgA和IgM均为阳性。其中1例IgA1：64（＋）、IgM1：16384（＋）为急性弓形虫感染件发葡萄胎。DIFA是一种敏感性高、特异性强、操作简便适用于孕妇弓形虫感染初筛的好方法，为达到优生优育监测弓形虫感染的目的，而采用DIFA、IFT－IgG、Toxo－IgG／IgA／IgM联合测试是较好的方案。

DIFA等四项免疫学方法检测血吸虫病合并弓形虫感染的研究

弓形虫ＩＨＡ和ＥＬＩＳＡ对急性血吸虫病有严重的交叉反应，影响弓形虫病的临床诊断。本文用ＤＩ－ＦＡ、ＩＦＴ、ＩＳＡＧＡ－ＩｇＧ和ＩＨＡ检测６６例急性血吸虫病，结果其阳性率分别为１９．７０％、２２．７３％、１６．６７％和６５．１６％；用ＤＩＦＡ和ＩＦＴ检测健康人群的弓形体阳性率为９％；还用上述方法检测两种病的混合血清和兔急性血吸虫病血清。通过比较、分析认为前三种方法可用于两病的鉴别。本文还用上述方法检测２１例慢性血吸虫病，阳性率在０～１９．０５％之间，无明显血清交叉反应。

多克隆抗体免疫荧光法检测大鼠卡氏肺孢子虫的研究

采用特异多克隆抗卡氏肺孢子虫囊壁抗体检测大鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织中卡氏肺孢子虫，被荧光抗体标记的肺胞子虫呈圆形或卵圆形，直径约3～6μm，为特异的苹果绿荧光色的囊壁。受检标本经PronaseE溶解包裹在肺孢子虫包囊外的糖蛋白等物质，其检出效果优于不用PronaseE方法者，亦优于传统的Grocott和Giemsa染色法。本方法具有高度的敏感性和特异性，与白色念珠菌、新型隐球菌无交叉反应。

4种免疫学方法联合检测乙肝患者的弓形虫抗体研究

为探明乙肝患者并发弓形体感染的状况，本文采用DIFA等四项免疫学方法联合检测87例乙肝患者及100例健康者的弓形虫抗体，并予以比较、分析。对乙肝患者，二项以上试验均为阳性者31例，占35．63％，明显高于健康者9％的阳性事。对乙肝患者DIFA和IFT的弓形虫特异抗体检出率分别为32．18％（38／87）、34．48（30／87）亦明显高于IHA的检出申（14．94％）。TOX-IgM-ISAGA检测弓形虫IgM的结果表明与抗-HBcIgM无相关性；乙肝人群的HBsAg、HBeAg、抗HBe、抗HbC分别与弓形虫抗体亦均无相关性。

多项免疫吸附凝集试验检测孕妇弓形虫感染的实验研究

用弓形虫ＩｇＧ／ＩｇＡ／ＩｇＭ免疫吸附凝集试验检测５０７份孕妇血清，并与ＤＡ、ＳＦＴ、ＩＳＡＧＡ－ＩｇＭＥＩＡ－ＩｇＭ多项方法检测结果比较分析。多项检测结果阴性的２０１份血清中，该法检测出ＩｇＧ阳性２１份，ＩｇＡ、ＩｇＭ均为阴性，较ＤＡ敏感；多项检测结果为非活动性弓形虫感染的２０３份血清中，该法检出ＩｇＧ阳性１９７份、ＩｇＡ阳性１１份、ＩｇＭ阳性４份，阳性率分别为９７．０５％、５．４１％、１．９７％两者结果基本相符；多项检测结果为活动性感染的１０３份血清中，该法检出ＩｇＭ阳性８７份，ＩｇＡ阳性６１份，ＩｇＧ阳性１０３份，其中ＩｇＭ阳性与单项的ＩＳＡＧＡ－ＩｇＭ阳性结果相符率较高为８３．０２％。弓形虫ＩｇＧ／ＩｇＡ／ＩｇＭ免疫吸附凝集试验盒可作弓形虫感染的定性、定量检测，对判定孕妇的弓形虫感染时间是较好的方法。

用弓形虫多功能免疫吸附凝集试验试剂盒检测孕妇弓形虫感染的实验研究

产前感染弓形虫是弓形虫病突出的问题,常分娩死胎及先天性弓形虫病的婴儿,胎儿发病与感染期密切相关。为避免产前感染的孕妇生育先天性弓形虫病的婴儿,应中止妊娠,因而早期诊断和监测极为重要。

用SSR-PCR和RAPD技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异

目的 对中国不同地域的旋毛虫株基因组DNA进行多态性分析 ,并为其种及种下分类提供依据。方法 采用微卫星锚定PCR(SSR PCR)及随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)对我国 6旋毛虫株基因组DNA进行PCR扩增 ,根据扩增产物电泳条带情况进行SAS分析 ,计算遗传距离并构建进化树。结果 T3、T7与国内各地域株间遗传距离均大于 0 85 ;湖北株与天津株、黑龙江株与云南株之间的遗传距离均小于 0 2。河南株与前 4株的遗传距离在SSR PCR小于 0 3,在RAPD小于0 6。结论 中国 6株旋毛虫在基因水平可分为不同层次的 3类 :a 湖北株、天津株为一类 ;b 黑龙江株、云南株为一类 ;c 不明株与河南株归为一类或者不明株归为a类中。国内 6株归属于T1。此外 ,国际标准株T3。

三地钉螺线粒体DNA两个分子的遗传变异研究

目的分析广西、云南、湖南三地钉螺线粒体DNA细胞色素C氧化酶Ⅰ(CO1)基因和细胞色素氧化酶b(Cytb)基因的遗传变异。方法收集广西靖西、云南洱源和湖南岳阳三地钉螺,提取其基因组DNA,PCR法扩增线粒体CO1和Cytb基因并测序。用ClustalW(1.82)软件对所测基因序列排序,用MEGA(3.1)计算其碱基组成、转换及颠换;用Kimura双参数法计算遗传距离,用非加权组平均法(UPGMA)和最大简约法(MP)构建系统发生树。结果PCR扩增获得CO1和Cytb基因大小分别约为700及600bp(含两侧引物)。三地钉螺CO1基因中共检测到106个多态性位点,约占核苷酸总数的15.9%,Cytb基因中多态性位点为165个,约占核苷酸总数的28.5%。广西靖西与湖南岳阳、广西靖西与云南洱源的钉螺CO1基因和Cytb基因的遗传距离分别为0.051、0.158和0.031、0.405。根据CO1和Cytb的基因序列,用上述两种方法构建的系统发生树结果均一致。广西靖西与湖南岳阳的钉螺同属一个支系,云南洱源钉螺单独形成另一支系。结论广西、湖南和云南的钉螺CO1和Cytb基因总体上具有相对丰富的多态性。

广西、湖南、云南三地钉螺Cytb基因序列变异和系统进化研究

目的分析广西钉螺与云南、湖南钉螺Cytb基因的遗传多态性和系统进化关系。方法收集广西靖西、云南洱源和湖南岳阳三地钉螺,提取其基因组DNA,PCR法扩增线粒体Cytb基因并测序。用Clustal W(1.82)软件对所测得的Cytb基因序列进行排序,用MEGA3.1计算其碱基组成、转换及颠换;用Kimura双参数法计算遗传距离,用非加权组平均法(UPGMA)和最大简约法(MP)构建系统发生树,同时结合三地钉螺分布和孳生地等资料进行分析。结果PCR扩增获得Cytb基因大小为580 bp。三地钉螺Cytb基因序列富含碱基A和T,A+T平均含量为61.2%,表现出较强的碱基组成偏倚。三地钉螺Cytb基因578 bp的同源序列中检测到165个变异位点,约占核苷酸总数的28.5%。其中广西钉螺与湖南钉螺Cytb基因序列的变异位点为17个,约占2.94%;广西钉螺与云南钉螺Cytb基因序列的变异位点为160个,约占27.7%。广西钉螺与湖南、云南钉螺Cytb基因的遗传距离分别为0.031、0.405。采用两种方法构建的系统进化树均显示广西钉螺与湖南钉螺同属一个支系,云南钉螺单独形成另一支系。结论广西钉螺与云南钉螺存在较大基因差异,进化速率较大,保守性较小,遗传距离较大,亲缘关系较远;广西钉螺与湖南钉螺基因差异较小,相对保守,进化速率不太大,遗传距离较小,亲缘关系较近。

不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异研究

目的 研究中国大陆及台湾地区不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异,为湖北钉螺种下分类提供依据。方法 收集13个地域株的湖北钉螺,高盐法抽提细胞内全部DNA ,PCR法扩增线粒体CO1基因,纯化并测序。将测序结果输入MEGA2程序,Kimura双参数法计算遗传距离,并分别用UPGMA法和最小进化法构建系统发生树。结果PCR扩增获得CO1基因大小约70 0bp(含两侧引物)。遗传距离显示:13个地域株明显被分为两组,其中四川株和云南株为一组,组内遗传距离为0 .0 35 ,其余为另一组,组内平均遗传距离为0 .0 14。而两组间的遗传距离为0 .12 9。两种方法构建的进化树拓扑结构基本一致。进化树分两大支,四川株和云南株位于一支,其它地域株位于另一支。结论13个自然隔离株湖北钉螺CO1基因总体差异不大,显示为一个种,其中四川、云南株与其它地域株差异显著,支持以往滇川亚种的结论,长江中下游各地域株CO1基因非常相近,支持指名(或湖北)亚种的分类方法。福建株、台湾株的分类地位有待进一步探讨。光壳和肋壳钉螺CO1基因无差异。

日本血吸虫Sj23DNA疫苗的增效研究

目的探讨缺失肿瘤转移有关基因ME491同源序列的日本血吸虫Mr23000膜蛋白基因(Sj23DNA)突变体疫苗的免疫效果。方法将Sj23DNA中与人黑素瘤细胞膜上的ME491同源序列进行基因缺失突变,再将突变基因转染真核细胞人胚肾HEK293细胞,通过间接荧光抗体试验(IFAT)检测其表达情况。将pcDNA3-Sj23突变体经股四头肌注射免疫小鼠(100μg/只),免疫后4周取注射部位肌肉作冰冻切片,IFAT检测目的基因的表达。40只BALB/c小鼠随机分成4组(每组10只),分别经股四头肌注射pcDNA3-Sj23突变体、pcDNA3-Sj23、空白质粒pcDNA3(均100μg/只)和生理盐水(30μl/只)免疫1次。免疫后4周用尾蚴攻击感染(40±2条/只)。第42天剖杀,肠系膜静脉灌注法及挤压法计数成虫,取肝脏计算每克肝组织虫卵数(EPG)。以减虫率和减卵率评价其免疫保护力。结果pcDNA3-Sj23突变体疫苗可在真核细胞HEK293中瞬时表达。pcDNA3-Sj23突变体在小鼠注射部位骨骼肌细胞上出现较强荧光,空白对照组未见特异性荧光。pcDNA3-Sj23突变体获得40.3%减虫率和42.8%减卵率,pcDNA3-Sj23获得33.1%减虫率和28.9%减卵率。两组差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论与pcDNA3-Sj23相比,缺失ME491同源序列的pcDNA3-Sj23突变体疫苗能诱导BALB/c小鼠产生更好的免疫保护效果。

日本血吸虫线粒体DNA两个分子的遗传变异

目的 从线粒体DNA的 2个分子 ,探讨我国日本血吸虫的遗传变异。 方法 试剂盒抽提基因组总DNA后 ,以特异性引物对线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)脱氢酶 1(ND1)和细胞色素c氧化酶I(COI)进行PCR扩增 ,将PCR产物分别测序 ,并以生物信息学方法加以比较 ,构建系统进化树。 结果 序列系统进化树显示日本血吸虫中国大陆株与中国台湾株之间差异较大 ,在树状图中可归为 2类 ;中国大陆山区型地域株 ,即云南洱源和四川天全在树状图中归为 1类 ;中国大陆湖沼洲滩型地域株 ,即湖南岳阳、江西新建和安徽贵池 3个地域株在树状图中处于并列位置 ;湖北省境内不同地域株在树状图中归为 1类。 结论 我国各地日本血吸虫存在不同程度的遗传变异 ,各地域株间亲缘关系密切 。

用RAPD技术对湖北大口等3地的钉螺遗传差异初探

目的对3个不同地点的湖北钉螺的遗传差异进行研究。方法采用随机引物扩增多态性DNA(RAPD)技术,对湖北省三个不同地域的钉螺进行PCR扩增,根据DNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果,计算湖北钉螺之间的遗传距离,绘制系统进化树,并结合形态学观察,生态环境调查,综合分析得出结论。结果不同地点湖北钉螺标本PCR扩增产物均呈多态性,钟祥市的大口与冷水距离很近,但两地的钉螺遗传距离大于远安县与钟祥市钉螺的遗传距离。大口林场的钉螺壳顶磨损明显。结论生态环境对遗传变异的影响较大,地理距离与遗传距离不成正比。