水稻谷蛋白的一个新基因克隆及表达分析

与其他禾本科作物以醇溶蛋白为主不同,水稻种子含有醇溶蛋白和谷蛋白两种主要蛋白质贮藏形式。其中,谷蛋白约占胚乳蛋白总量的70%-80%。水稻谷蛋白是由多基因家族编码合成的,到目前为止至少已克隆获得了9个全长cDNA,根据这些cDNA编码的氨基酸序列同源性可将谷蛋白分为A、B两个亚家族。B亚族谷蛋白成员富含赖氨酸等人体必需氨基酸,与稻米的营养品质直接相关,因此挖掘、利用B亚族基因成员对于改良稻米蛋白品质性状至关重要。本文报道了以32P标记的谷蛋白基因GluB-2cDNA片段为探针筛选水稻胚乳cDNA文库获得1个新的水稻谷蛋白基因全长cDNA。序列分析显示该基因核苷酸序列共1588 bp,含有1个由495个氨基酸残基组成的开放阅读框,编码蛋白分子量约为56 kD。推导的氨基酸序列与其他已知谷蛋白基因家族成员间序列相似性介于57.8%-97.8%之间,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB-7(GenBank注册号AY987390)。Northern杂交显示,GluB-7具有高度的胚乳表达特性。

Trxs基因对啤酒大麦籽粒灌浆后期抗氧化能力和荧光参数的影响

为了深入探索Trxs基因的功能,给转基因大麦育种提供理论依据,以啤酒大麦品种Harrington及其过量表达硫氧还蛋白S基因(Trxs)的转基因大麦株系为试验材料,对籽粒灌浆后期旗叶中还原型谷胱甘肽(GSH)含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、叶绿素荧光特性以及不同发育阶段籽粒中GSH含量和产量性状进行研究。结果显示:(1)籽粒灌浆后期转基因大麦旗叶GSH含量与APX活性显著高于非转基因对照;(2)花后15 d时各测定时间点和籽粒灌浆后期不同测定时间转基因大麦旗叶叶绿素荧光参数Fv/Fm与Fv/Fo值普遍高于对照;(3)转基因大麦的产量性状优于对照,其千粒重、单株穗数和单株产量平均分别比对照提高了12.29%、34.34%与41.01%。这些结果表明,Trxs通过影响旗叶和籽粒中GSH含量和旗叶中APX活性,提高了籽粒灌浆后期转基因啤酒大麦抗逆境胁迫的能力,改善了啤酒大麦转基因株系在籽粒灌浆后期的光合性能,有利于提高了单株产量。

小麦16.9kD热激蛋白cDNA克隆及其表达分析

为进一步了解小分子量热激蛋白在小麦耐热能力中的作用，根据玉米16.9 kD小分子热激蛋白的氨基酸序列，采用同源序列法进行序列拼接和引物设计，用RT-PCR扩增获得了1个源自小麦叶片的热激蛋白基因cDNA片段，即TaHSP16.9-1（GenBank登录号为EU649679）。TaHSP16.9-1全长770 bp，5′非翻译区81 bp，3′非翻译区233 bp，开放阅读框编码151个氨基酸。序列分析结果表明，此蛋白与已知单子叶植物来源的同类基因高度同源，相似性介于78.3%-96.7%之间。定量RT-PCR表达谱分析显示，TaHSP16.9-1在小麦抽穗期的茎和旗叶以及幼苗期叶片中均能表达，其在小麦幼苗叶片中的表达受高温胁迫的诱导。

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库，获得与之高度同源的水稻基因组序列，通过生物软件进行基因预测和验证，用RT—PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明，该基因eDNA序列全长为1517bp，含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF），推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53．6％～82．8％，并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高，因此命名为GluB-6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示，GluB-6基因具有高度的胚乳表达特性。

转Trxs基因大麦品系Y002麦芽品质分析

对转Trxs基因大麦品系Y002种子的发芽特性、麦芽品质及其相关指标进行了研究,结果表明:(1)转基因品系Y002的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等项指标分别比对照TrankgLin增加了9.70%、11.11%、10.37%和7.20%;(2)品系Y002的麦芽品质优于对照,其叶芽长度、糖化力、a-氨基氮、可溶性氮和库尔巴哈值分别为对照的1.03倍、1.03倍、1.11倍、1.09倍和1.13倍;(3)品系Y002种子发芽期淀粉酶和蛋白酶活性显著高于对照;(4)品系Y002种子的B组醇溶蛋白聚合程度加剧,萌发期降解速率显著快于对照,并且出现特异的蛋白条带。综上所述,转基因大麦品系Y002的酿酒品质显著优于对照,可作为培育优质啤酒大麦品种的理想材料。

大麦铁蛋白基因(HvFer1)cDNA的克隆和表达

根据玉米铁蛋白ZmFer1的氨基酸序列,采用同源序列法进行序列拼接和引物设计,RT-PCR扩增获得了1个源自二叶期大麦叶片mRNA的大麦铁蛋白基因cDNA片段,HvFer1(GenBank登录号为EF440353)。HvFer1全长1023 bp,5′非翻译区56 bp,3′非翻译区202 bp,开放阅读框编码254个氨基酸。序列分析表明,此蛋白与已知植物铁蛋白高度同源,相似性介于56.7%～83.7%之间,N端具27个氨基酸的信号肽,C端(84～247)具有1个类似铁蛋白的功能域。RT-PCR表达谱分析显示,HvFer1在大麦的茎、叶、幼穗和幼根均能表达,茎和幼穗中表达量略高些。此外,HvFer1受PEG和盐胁迫的强烈诱导表达,中度铁胁迫也可不同程度地增加HvFer1的表达量。

小麦AQPs蛋白TaPIP1基因cDNA克隆及其表达分析

为探索小麦水通道蛋白在氮素处理过程中的生物学功能,以0.1%尿素处理6.0 h的周麦19幼根为材料,利用RT-PCR方法克隆了小麦PIPs类型的水通道蛋白基因TaPIP1,并分析了该基因的组织表达特性及其在尿素处理过程中的表达特征。TaPIP1全长1 062 bp,包括61 bp的5′非翻译区,128 bp的3′非翻译区和一个长度为873 bp、编码290个氨基酸的开放阅读框。序列分析表明,TaPIP1基因与已知小麦（GQ452384和AAM00368）、大麦（BAA23746,CAA54233和BAA23745）、水稻（BAA24016）和玉米（AAK26754,ACG39699,ACG37183,CAA57955和AAK26756）等单子叶植物来源的同类基因同源性较高,相似性为85.9%-99.3%。半定量RT-PCR表达谱分析显示,TaPIP1在抽穗期小麦的根、茎和旗叶中均能表达。氮素处理下该基因表达分析结果显示,TaPIP1在萌发期小麦根系中的表达受尿素的诱导。

水分胁迫对欧李光合速率日变化的影响

通过不同程度的水分胁迫对欧李叶水势、气孔导度、蒸腾速率和光合速率日变化影响的研究。结果表明在水分胁迫下,欧李叶水势、气孔导度、蒸腾速率和光合速率降低,且随胁迫程度加剧而增大。水分胁迫使欧李光合速率日变化曲线由单峰型变成双峰型。

区域化探找矿新案例—甘肃代家庄铅锌矿的发现

代家庄铅锌矿是在甘肃省用地球化学勘查方法发现的第一个大型铅锌矿床。作者回顾了发现该矿床的简史,研究了矿床地质、地球化学特征,探讨矿区进一步找矿的远景,讨论应用地球化学勘查方法寻找铅锌等有色金属矿产的经验和教训。

西洋参种子抑制物质的初步研究

本研究证实了西洋参种子中确有发芽抑制物质存在．种子中各部位的抑制物活性依次为果肉＞胚乳＞内果皮，而果肉中的抑制物质则主要存在于乙醚相和甲醇相中．１０５℃高温不能使大部分的发芽抑制物质失去活性。

水分胁迫条件下“洛旱2号”小麦根系的基因表达谱

为探讨小麦水分胁迫反应的分子调控机制,以抗旱小麦品种"洛旱2号"根系为材料,采用Affymetrix小麦基因芯片比较了20%PEG6000溶液处理后根系及对照的基因表达谱。结果表明,洛旱2号根系中受水分胁迫诱导而上调和下调表达的基因分别有3743个(4074个探针组)和4573个(5043个探针组),下调表达的基因远远多于上调表达的基因,其中上调2倍以上的1593个(1716个探针组),下调2倍以上的2238个(2451个探针组)。通过Affymetrix的Net Affx Analysis Center查询和NCBI的BLASTx分析,差异表达2倍以上的基因中有619个已注释了功能,利用MIPS数据库将注释基因分为10类,包括生物代谢、逆境胁迫反应、细胞组分生成、蛋白合成、细胞信号交流、细胞运输、转录相关、细胞分裂和蛋白质加工等。差异表达16倍以上的基因中有32个已注释了功能,其中与逆境胁迫反应相关的基因16个,与生物代谢相关的基因5个。利用实时定量RT-PCR对8个代表性候选基因在水分胁迫条件下的差异表达特性分析表明,其结果和芯片杂交分析的结果基本一致。

小麦品种抗旱性与深根性和深层根系活性的关系

为明确小麦根系垂直生长与抗旱能力的关系,以不同抗旱类型品种洛旱6号、西农979和郑麦366为材料,在柱栽条件下研究了不同生育时期最大根深、根干重垂直分布、根系活性垂直变化等性状。结果表明,本试验条件下,小麦根深在挑旗期达最大值,越冬至挑旗期间根系生长速度快。挑旗期和抽穗期不同抗旱类型品种间根深差异显著,其中抗旱性强的品种最大根深较大;与抗旱性弱的品种相比,抗旱性强的品种总根干重和深层根干重小,根系生理活性强。籽粒灌浆期表现为抗旱性越强,深层根系生理活性越强。据此认为,抗旱性强的小麦品种未必具有较大的根干重或深层根干重,但其根系下扎深且深层根系生理活性较强,尤其是生育后期的根系生理活性强。

小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的克隆及其对非生物胁迫的响应

【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分析显示,TaPM19-1可形成4个由α-螺旋组成的跨膜域,N端位于膜内,包含由27个氨基酸组成的信号肽,C端近40个氨基酸位于膜内。表达分析显示,TaPM19-1除在发育后期的种子中有较高水平表达外,其它组织中未检测到表达;在所检测的2个小麦品种根系中,TaPM19-1的表达受ABA诱导,但在叶片中的表达量极低;水分胁迫条件下,该基因在根系和叶片中均呈现较强的诱导表达特性;在高盐和高温胁迫条件下,该基因在洛旱2号小麦中均可诱导表达,而在中国春小麦中未检测到该基因表达;在低温胁迫条件下,未检测到TaPM19-1的表达。【结论】获得了小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的cDNA全长,其编码蛋白可形成典型的跨膜结构特征;该基因受植物激素ABA的诱导,在洛旱2号中也可被干旱、高盐和高温胁迫诱导,但在中国春中对高盐和高温胁迫无响应。推测TaPM19-1在洛旱2号和中国春中存在不同的转录调控机制。

小麦穗发芽与籽粒内可溶性糖和α-淀粉酶活性的品种差异

为了探索不同小麦品种潜在穗发芽能力存在的差异，分别对豫麦34、豫麦18、豫麦70和豫麦49等4个河南主栽小麦品种在籽粒发育后期的潜在发芽势、可溶性糖含量和α-淀粉酶活性进行了测定，结果表明，①所有品种在开花20d后均有一定的发芽能力，其中豫麦34潜在发芽能力明显高于其他几个参试品种；②豫麦34籽粒可溶性糖含量相对较高，而豫麦18最低，且4个品种在花后20d的可溶性糖含量都略有升高的趋势，而在花后25～30d又开始下降；③α-淀粉酶活性与可溶性糖含量的变化规律在整个籽粒发育过程中大体呈一致趋势；④穗发芽率与籽粒可溶性糖含量及α-淀粉酶活性呈正相关关系，豫麦34和豫麦49的籽粒可溶性糖含量与α-淀粉酶活性达极显著正相关。因此，小麦穗发芽现象与籽粒内较长时间维持高的可溶性糖的含量和α-淀粉酶活性有密切关系。

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以c DNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97%以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因c DNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过Eco RⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体p MAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L-1IPTG诱导1—5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦c DNA全长序列,命名为Ta C2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框(ORF),5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 k D,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域(C2-domain)。多序列比对及进化树分析表明,Ta C2DP1与乌拉尔图小麦Tu C2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示Ta C2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体p MAL-c2X-Ta C2DP1,在IPTG诱导下得到90 k D左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行Ta C2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。Ta C2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,Ta C2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,Ta C2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta C2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,Ta C2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。

过量表达Trxs对铝胁迫下转基因大麦幼苗根系抗氧化酶系的影响

为了解硫氧还蛋白的过量表达对提高植物抗铝毒能力的作用,以过量表达硫氧还蛋白S基因(Trxs)的转基因大麦为材料,采用水培法研究0.05 mmol/L AlCl3胁迫条件下转基因大麦株系(LSY-11-1-1)幼苗根系谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶活性的变化,以及蛋白质和膜脂氧化损伤程度。结果表明,(1)在0.05 mmol/L AlCl3处理下,大麦幼苗根中蛋白质羰基含量和丙二醛含量显著高于非胁迫处理样品,但是转基因大麦的蛋白质羰基含量和丙二醛含量显著低于非转基因对照,如在铝胁迫处理的6、24、48、72和96 h时转基因大麦幼苗根中蛋白羰基含量分别只有对照的68.13%、52.39%、56.18%、58.02%和60.48%,MDA含量分别是对照的71.26%、74.47%、83.05%、73.65%与75.31%。(2)胁迫处理下大麦根系GSH-PX、CAT和APX等抗氧化酶活性出现不同程度的增加;与非转基因对照相比,转基因大麦幼苗根系抗氧化酶系的活性普遍高于对照,如GSH-PX活性在处理的3、24、48、72和96 h时分别是对照的1.1、1.2、1.8、1.6和1.6倍;APX在活性高峰时分别是对照的121%(3h)和119%(96 h);CAT活性在胁迫处理的3、12、24、48和72 h分别比对照提高了62%、11%、7%、34%和17%,而且转基因幼苗根系CAT活性高峰(处理3 h)比对照提前出现21 h(处理24 h)出现。这些结果表明过量表达Trxs可以有效地提高上述抗氧化酶类的活性,缓解铝毒对大麦根系蛋白质和膜脂的氧化损伤,从而提高转基因大麦幼苗对铝胁迫的抗性。

黄淮麦区21个小麦品种中春化基因VRN1的组成分析

为了明确黄淮麦区小麦品种的春化基因组成,采用序列特异性PCR扩增技术分析了21个小麦品种春化基因VRN1的显隐性组成特性。结果表明,所检测品种中没有发现VRN1在A基因组为显性(Vrn-A1)的基因型;偃展1号中VRN1在B和D基因组均为显性;周麦19、豫农949、郑麦004、洛麦21、豫麦18、矮抗59和偃展4110中,春化基因VRN1在D基因组中为显性;豫麦49、豫麦70、小偃81、郑麦366、豫麦70-36、温麦8号、洛旱2号、温麦19、豫农301、周麦16、平安3号、众麦1号和阜麦936中,春化基因VRN1在A、B和D基因组均为隐性。

高温胁迫对不同小麦品种幼苗叶片中抗氧化酶活性的影响

以2个耐热性存在差异的小麦品种中国春和偃展4110为材料,采用42℃高温对4叶1心幼苗进行时间梯度胁迫处理,研究高温胁迫对小麦幼苗叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性的影响。结果表明,高温胁迫可显著诱导小麦叶片中SOD和POD活性,并表现为先升后降,CAT的活性总体呈现下降趋势;抗氧化酶活性在2个品种间存在差异,偃展4110的SOD和CAT活性显著高于中国春,而中国春的POD活性在胁迫早期与偃展4110无显著差异,胁迫后期显著高于偃展4110。

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式【。结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列(GenBank登录号:JN650603),命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。

转外源Trxs基因大麦耐盐性有关生理生化特性分析

以过量表达硫氧还蛋白s基因(Trxs)的转基因大麦株系(LSY-11-1-1)及其非转基因对照(CK)为试验材料,研究了50mmol/L盐胁迫条件下,Trxs过量表达对大麦幼苗耐盐性有关生理生化特性的影响。结果显示:盐胁迫下转基因大麦的鲜重与干重高于对照,而丙二醛(MDA)与羰基含量低于对照。盐胁迫下转基因大麦幼苗叶片的过氧化物歧化酶(SOD)活性与过氧化氢酶(CAT)活性普遍高于对照。转基因大麦类囊体中铁蛋白大量积累的持续时间比对照长。由此可以推测,Trxs至少可以通过两条途径缓解盐胁迫对大麦幼苗生长的抑制作用:一方面增强抗氧化酶活性、有效清除过量产生的活性氧;另一方面能促进铁蛋白含量的增加、抑制Fenton反应来减少活性氧的过量产生,从而赋予转基因大麦幼苗更强的抗盐胁迫能力。