禽源大肠杆菌荧光定量PCR方法的构建及应用

为建立一种灵敏、准确且快速检测禽源大肠杆菌的方法,根据禽源大肠杆菌uidA基因的一节特异性保守序列设计引物,建立用于禽源大肠杆菌的荧光定量PCR(qPCR)检验方法,并对其各方面进行评价。试验数据表明所建立的qPCR方法的Ct值与标准品在4.69×10^(2)~4.69×10^(9 )copies/μL范围内存在优良的线性关系,线性相关系数为R2=0.993;该方法标准曲线方程为y=-3.2786x+39.032,熔解曲线表现为单峰,不存在非特异性扩增。对重组质粒标准品的最低检测浓度为4.69×10^(2) copies/μL,是普通PCR方法的1000倍。该方法检测临床样本阳性率为68.3%(41/60),普通PCR阳性检出率为23.3%(14/60),阳性检出率高出45%。此次研究建立的检测禽源大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法可用于禽源大肠杆菌的快速诊断,对于禽大肠杆菌病的监测具有重要意义。

禽源沙门氏菌荧光定量PCR方法的构建及应用

试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作为标准阳性模板。经qPCR条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的Ct值与标准品在1.4~1.4×10^(10)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.9963,扩增效率为95%,检测下限为1.4拷贝/μL;与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾志贺菌、多杀性巴氏杆菌无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.5%;对44份粪便样本和132份蛋液样本进行qPCR方法和常规PCR方法检测,结果显示该qPCR方法的阳性检出率分别为22.7%(10/44)、0.8%(1/132),常规PCR的阳性检出率分别为9.1%(4/44),0%(0/132)。结果表明:试验成功建立禽源沙门氏菌qPCR检测方法,可为禽源沙门氏菌的快速检测提供技术支撑。

产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的多重PCR检测方法构建

为了建立一种可同时检测禽产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和沙门氏菌(Salmonella)的多重PCR方法,针对产肠毒素大肠杆菌致病基因Hly E、沙门氏菌特异基因inv A的基因保守区域合成两对特异性引物(目的片段为550 bp和825 bp),通过优化反应条件建立多重PCR检测方法,并反复验证分析其特异性、灵敏性和重复性,同时应用该方法对临床样本进行初步应用。结果显示:该方法可从同一样品中同时特异性扩增产肠毒素大肠杆菌Hly E基因、沙门氏菌inv A基因目的条带,对其他菌株均不能扩增出目的条带;检测沙门氏菌和产肠毒素大肠杆菌的灵敏度分别为0.078 ng/μL和0.78 ng/μL,且重复性良好。用建立的多重PCR方法对采集的59份粪便样品进行检测,分别检出产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的样本为13份和7份,同时携带产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的样本检出7份。该方法特异性、灵敏性、重复性良好,为鉴别诊断这两种细菌所致鸡腹泻病提供了一种快速准确的检测途径。