96KD糖蛋白诱导肿瘤免疫的实验研究

目的 从 H2 2肝癌细胞中纯化 96 KD糖蛋白 ,并观察其诱导肿瘤免疫作用。方法 ( 1)分离 96 KD糖蛋白 :H2 2肝癌细胞破膜、可溶性蛋白分级硫酸铵盐析、Co A- Sepharose亲和层析、DEAE- Sephacel离子交换层析分离、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 ( 2 )诱导肿瘤免疫 :用不同剂量 96 KD糖蛋白分别皮下免疫 5组小鼠 ,每周 1次 ,连续两周 ,末次免疫后的第 7天用 2× 10 5H2 2细胞攻击 ,观察各组肿瘤发生率及瘤重并与对照组比较。结果 不同剂量免疫组皆显示保护作用 ,用 18μg/只 96 KD糖蛋白免疫组效果最明显。结论 使用从 H2 2肝癌细胞中分离的 96 KD糖蛋白免疫小鼠后 ,对同类癌细胞攻击显示有效的免疫保护作用。

热休克蛋白gp96肽复合物诱导的抗肿瘤免疫

目的: 用不同种类肿瘤提取的热休克蛋白 (HSP)gp96 肽复合物纯化后免疫动物,观察其诱导抗肿瘤免疫的效应,并初步探讨其机制。方法: 从肿瘤细胞中制备HSPgp96 肽复合物, 观察其免疫诱导作用。用不同剂量及不同来源的gp96 肽复合物免疫 6组小鼠后, 用H22癌细胞攻击, 观察各组小鼠的肿瘤发生率、瘤重及瘤组织的形态学变化并与对照组相比较。观察gp96 肽复合物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮 (NO)和杀瘤活性的影响。结果: 获得的纯化HSPgp96 肽复合物的Mr为 96 000。gp96 肽复合物的免疫效果与其剂量有关, 以 18μg/只的效果最明显。交叉免疫实验证明, 免疫小鼠能抵抗同种肿瘤细胞的攻击, 而对异种肿瘤细胞的则无免疫保护作用。gp96 肽复合物可刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO同时杀瘤活性增高。结论: 从肿瘤细胞中分离纯化的HSPgp96 肽复合物免疫小鼠后, 可获得特异性的抗肿瘤作用; 其对肿瘤细胞的杀伤作用与gp96 肽复合物能增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO增多有关。

热休克蛋白gp96-肽复合物的提取及纯化

目的:建立从H22肝癌细胞中提取、纯化热休克蛋白gp96肽复合物的方法。方法:①制备H22肝癌细胞蛋白:将H22肝癌细胞裂解、离心、过滤及透析后获得。②gp96肽复合物的纯化:上述可溶性H22肝癌细胞蛋白经分级硫酸铵盐析后,依次用ConASepharose亲和层析、SephadexG25更换缓冲液及DEAESephacel离子交换层析分离纯化。③gp96肽复合物的鉴定和浓度测定:所得蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot进行蛋白分子量及性质鉴定,Lowry法测定蛋白浓度。结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染鉴定为单一带,分子量为96kD;Westernblot结果证实为HSPgp96。每20ml压积H22细胞最终获得1mg的HSPgp96。结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度HSPgp96肽复合物。

黏附分子αvβ3和αvβ5介导肿瘤细胞与肿瘤内皮细胞的黏附

目的体外分析黏附分子αvβ3和αvβ5及其配体Dd-1、L1在肿瘤细胞-内皮细胞黏附中的作用。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和流式细胞分析比较正常肝窦内皮细胞（LSEC）和肝癌的血管内皮细胞T3A上细胞间黏附分子1（ICAM-1）、αvβ3和αvβ5的表达以及缺氧对其表达的调控。分别用RT—PCR和Western blot方法分析6种肿瘤细胞Del-1和L1的表达及缺氧对其表达的调控。使用连续光谱荧光测定仪定量肿瘤细胞在LSEC和T3A上的黏附，并分析抗不同黏附分子的抗体和siRNA对肿瘤细胞-内皮细胞黏附的阻断作用。结果T3A细胞αvβ3和αvβ5的基础表达高于LSEC，而ICAM-1的基础表达低于LSEC。缺氧上调两种内皮细胞αvβ3和αvβ5的表达，而ICAM-1表达仅在LSEC中升高。在不同肿瘤细胞中，Del-1和L1的基础表达存在明显差异，并且在缺氧条件下受到明显不同的调节。Del-1和L1高表达的肿瘤细胞在T3A细胞的黏附明显高于LSEC，并且在缺氧条件下黏附明显增加，这种黏附可以被抗αvβ3、αvβ5的抗体或沉默p3和p5的小干扰RNA（siRNA）阻断。结论细胞黏附分子αvβ3、αvβ5及其配体在肿瘤细胞-肿瘤内皮细胞的黏附过程中起重要介导作用。

人海绵状血管瘤内皮细胞特性的体外研究

目的研究人海绵状血管瘤内皮细胞在形态、表型和功能方面的改变。方法从人海绵状血管瘤组织分离、纯化血管内皮细胞,并应用透射电子显微镜、流式细胞术、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、明胶酶谱法和激光共聚焦显微镜等技术与人正常人肝窦内皮细胞进行比较分析。结果与正常人肝窦内皮细胞相比,人海绵状血管瘤内皮细胞的超微结构上,具有异常膨大的内质网和空泡样结构;表型上,高表达整合素αvβ3;功能上,体外形成血管样网络结构异常,并可能与其高表达的内源性血管内皮细胞生长因子、血管生成素1以及基质金属蛋白酶2有关。结论人海绵状血管瘤内皮细胞在形态、表型和功能特性上都不同于正常肝窦内皮细胞。