紫外分光光度法测定饲料预混剂中磷酸泰乐菌素的含量

采用紫外分光光度法测定饲料预混剂中磷酸泰乐菌素的含量。试验结果表明,磷酸泰乐菌素的的最大吸收波长为289nm,在此波长处,磷酸泰乐菌素的质量浓度在5.0～50.0μg/ml,其吸光度与质量浓度呈现良好的线性关系:A=0.026 9x+0.028 6,R2=0.999 9(n=6)。该方法操作简单快速,结果准确,可用于饲料预混剂中磷酸泰乐菌素含量的测定。

稀有鲫热激蛋白70的分子克隆及表达特征分析（英文）

为研究稀有逗鲫(Gobiocypris rarus)HSP70用于淡水毒理学和风险评估方面的可行性,通过cDNA末端快速扩增的方法首次从稀有逗鲫肝脏中成功克隆出HSP70基因的cDNA全长,命名为GrHSP70。NCBI比对分析结果显示,GrHSP70核苷酸序列与其他鱼类的HSP70基因的核苷酸序列相似性极高,相应的氨基酸序列同源性也高(大于95%)。通过实时定量PCR获得未经污染物暴露的稀有逗鲫幼鱼体内13种组织中GrHSP70的分布以及PCP暴露后肝脏中该基因的表达图谱,结果表明GrHSP70在稀有逗鲫体内的表达呈现出组织依赖性,在性腺组织中的表达最高。此外,在不同时间﹑不同浓度的PCP暴露下稀有逗鲫肝脏中GrHSP70的表达模式呈现出显著的时间-剂量依赖效应。总之,GrHSP70可作为一种非常敏感的生物标志物,适用于中国淡水环境污染的毒理学研究及风险评估。

DSPAα1缺失突变体在毕赤酵母中的表达及活性研究

吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Desmodus salivary plasminogen activators,DSPAs)共有4种:DSPAα1、α2、β及γ。其中,DSPAα含有指形区(F)、表皮生长因子区(E)、kringle区(K)和丝氨酸蛋白酶区(P),DSPAβ含E、K、P区,DSPAγ含K和P区。以DSPAα1为基础,研究其结构对纤溶活性的影响。采用重叠延伸PCR技术(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)获得缺失E区的DSPAα1突变体(m DSPAα1),分别构建m DSPAα1/p PIC9K、DSPAβ/p PIC9K和DSPAγ/p PIC9K重组质粒并转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115中表达,纤维平板法测活。结果显示未检测到DSPAγ的表达,DSPAα1活性为2.64×105 U/mg,DSPAβ的活性为1.32×104 U/mg,m DSPAα1活性为151.52 U/mg;同时使用DSPAα1、m DSPAα1、DSPAβ时,总活性几乎不受影响,单独使用任意两者时,发现活性均降低2-3倍。m DSPAα1纤溶活性几乎没有,同时DSPAβ与野生型DSPAα1相比保留了相当的催化活性。DSPAα1的N端区域可以影响其溶栓活性,而缺失E区后几乎丧失活性,说明E区在DSPAα1溶栓过程中起着至关重要的作用。

重组人死亡受体6胞外结构域的制备及与淀粉样前体蛋白N端片段相互作用鉴定

人淀粉样前体蛋白氨基端切割片段(a cleaved amino-terminal fragment of amyloid precursor protein,N-APP)结合死亡受体6(Death receptor-6,DR6),会触发神经元和轴突依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的自我毁灭过程,从而导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生。为了在分子水平上研究N-APP-DR6诱导神经元退化途径,制备大量纯化的重组DR6胞外结构域以及鉴定NAPP和DR6胞外结构域的结合位点是关键。从甲醇毕赤酵母中成功表达并纯化了重组DR6胞外域(aa42-349),得率高达90 mg/L。为了验证DR6和NAPP的相互作用关系,构建谷胱甘肽转移酶-死亡受体6(GST-DR6)(aa42-349)融合蛋白原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21,表达融合蛋白GST-DR6(aa42-349),同时纯化得到DR6的配体NAPP,GST pull-down结果显示DR6与NAPP能够在细胞外发生相互作用。

密码子优化后的αB-晶状体蛋白基因毕赤酵母重组质粒的构建及表达的初步研究

αB-晶状体蛋白属于小热休克蛋白家族,具有分子伴侣活性。在阿尔茨海默病大脑中,星形胶质细胞表达的αB-晶状体蛋白明显上调,并且这些上调的αB-晶状体蛋白紧密地分布在β-淀粉样蛋白沉积周围。为了在分子水平上研究胞外αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中的作用机制,需要获得大量具有生物学活性的αB-晶状体蛋白。根据毕赤酵母密码子偏好性对人αB-晶状体蛋白基因进行优化,并在目的基因3'端加上6个组氨酸标签,优化后的基因克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体p PIC9K上;电转入毕赤酵母GS115中;优化确定最佳表达条件为:BMGY与BMMY的转接比为2∶1,表达时间为72h,甲醇补加终浓度为0.5%;经Western blotting鉴定,获得20kDa的目的蛋白,以及18.6kDa和13.1kDa两个蛋白质片段,重组目的蛋白出现了部分降解,纯化获得20kDa目的蛋白;利用胰岛素还原法测定该片段具有分子伴侣活性,为进一步研究外源αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中对星形胶质细胞的保护机制奠定基础。