三维生物打印结合海藻酸钠和纤维蛋白原构建仿生尿道修复补片的实验研究

目的将三维(3D)生物打印技术应用于尿道修复补片的构建,并评估其力学性能、细胞活力和临床应用可行性。方法以兔尿道组织和脱细胞基质作为模板,分离兔尿道成纤维细胞,应用3D生物打印技术结合海藻酸钠和纤维蛋白原水凝胶共同制备两种负载兔成纤维细胞的仿生尿道修复补片:仿生尿道修复补片1(单纯海藻酸钠水凝胶构建的尿道补片)和仿生尿道修复补片2(在海藻酸钠水凝胶基础上使用纤维蛋白原水凝胶构建的尿道补片)。通过生物降解实验和生物力学测试分别评估仿生尿道修复补片1的生物降解性和力学性能。通过细胞活性染色,观察并计算0、3、6 d仿生尿道修复补片1和2内细胞的存活率。通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验检测仿生尿道修复补片2内纤维蛋白原水凝胶中细胞的扩增速率,以分光光度计吸光度(A值)表示。结果生物降解实验结果显示,仿生尿道修复补片1在Ⅱ型胶原酶溶液和灭菌水中均有明显的降解,10 d内其在Ⅱ型胶原酶溶液中的降解速率显著快于在灭菌水中,10～20 d时的降解速率较在灭菌水中平稳,>20～<30 d时与在灭菌水中同步,30 d时其在两种溶液中的降解率均接近50%。生物力学测试结果显示,仿生尿道修复补片1的力学性能表现为线性增加,最大牵拉强度为6 N。细胞活性染色结果显示,仿生尿道修复补片1内的细胞为点状分布,无明显的舒展,细胞死亡率较高,细胞在培养0、3、6 d的存活率分别为62.91%±3.39%、41.92%±8.86%和57.11%±6.12%;仿生尿道修复补片2内细胞形态舒展,死亡率较低,在培养第6天时即有明显的细胞扩增,细胞在培养0、3、6 d的存活率分别为95.12%±1.37%、79.46%±4.77%和84.70%±8.62%。CCK-8实验结果显示,仿生尿道修复补片2内纤维蛋白原水凝胶中的细胞,在培养1、4、7、10、15 d的扩增率的A值分别为0.012 752 083、0.131 895 833、0.208 958 333、0.430 608 333、0.623 875 000,有明显的扩增表现。结论生物打印技术能够制备力学性能充足、细胞活性良好的3D立体尿道结构,证实了生物打印技术在尿道修复领域应用的可行性,为生物打印尿道的体内研究奠定了研究基础。

T2 mapping及扩散张量成像在兔坐骨神经损伤中的应用

目的探讨T2 mapping及扩散张量成像(DTI)在评估兔坐骨神经损伤中的价值。材料与方法选择15只新西兰大白兔,建立右侧坐骨神经夹伤模型,左侧为对照侧。所有兔于损伤后3 d及1、2、3、4周行T2 mapping和DTI扫描。MRI扫描完毕后,于各时间点取1只白兔行病理检查。分析损伤侧坐骨神经各时间点的T2值和各向异性分数(FA)值,并运用改良Tarlov评分和趾展反射评分评价肢体功能恢复情况。结果兔坐骨神经夹伤远端3 d T2值上升,FA值下降,与对侧比较差异有统计学意义(P<0.05);1~4周T2值下降,FA值上升,与对侧比较差异有统计学意义(P<0.05);神经夹伤近端3 d T2值升高,FA值下降,1周恢复正常,与对侧比较差异无统计学意义(P>0.05)。坐骨神经损伤后T2值与功能评分呈负相关(r=-0.884,P<0.05);FA值与功能评分呈正相关(r=0.975,P<0.05)。结论 T2 mapping及DTI序列能够定量测定坐骨神经的损伤情况,可用于评估兔坐骨神经损伤的变化。

取向性生物导电型材料的制备及对神经再生的影响

目的:通过不同方法研制出取向性静电纺丝复合材料,确定材料与神经再生之间的构效关系,为理想的神经再生植入装置的设计提供扎实的理论基础,为周围神经缺损的修复提供更有效的方法。方法:本实验通过切片法结合静电纺丝及3D打印等技术制备具有取向性的丝素(silk fibroin,SF)/石墨烯(Graphene,Gr)复合材料。显微镜观察材料表面结构形貌。电化学分析提供复合材料的电活性表征。细胞共培养观察该复合材料对神经细胞的影响。结果:不同方法制备的不同取向性复合材料具有不同的导电性,其中3D打印生成取向性的静电纺丝复合材料具有良好的导电性,并且通过体外细胞实验表明其支持培养的施万细胞的存活和生长,揭示其具有良好的生物相容性。结论:结果均表明3D打印取向性复合材料结合了优秀的导电性能与良好的生物相容性等性质,很好地模拟了神经发育的天然神经细胞微环境。

静电纺丝石墨烯/丝素蛋白纳米膜的构建及体外生物相容性研究

目的探索以石墨烯(graphene,Gr)和丝素蛋白(silk fibroin,SF)为原料,采用静电纺丝技术制备Gr-SF纳米膜方法,并评价Gr-SF纳米膜体外生物相容性。方法取Gr和SF溶于甲酸溶液,按照不同Gr质量分数(0、5%、10%、15%、20%)配制静电纺丝溶液,测定溶液静态接触角。采用静电纺丝技术制备0、5%、10%、15%、20%Gr-SF纳米膜(分别为A、B、C、D、E组),光镜和扫描电镜观察其结构,电化学工作站循环伏安法测定电导率,正己烷溶液置换法测定孔隙率,采用L929细胞以细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法评价细胞毒性。取原代培养的SD大鼠雪旺细胞与各组Gr-SF纳米膜共培养3 d,甲苯胺蓝染色观察雪旺细胞生长形态和分布,CCK-8法检测细胞黏附情况,Ed U/Hoechst33342染色检测细胞增殖情况。结果静态接触角检测显示随Gr质量分数增大,Gr-SF静电纺丝溶液亲水性降低。光镜和扫描电镜观察示Gr-SF纳米膜具有纳米纤维结构,Gr颗粒分散在纳米膜中,Gr质量分数增加会促使颗粒聚集。孔隙率检测示Gr-SF纳米膜均具有高孔隙率(>65%),随Gr质量分数增加,Gr-SF纳米膜的孔隙率和电导率均逐渐增加,C、D、E组均高于A组(P<0.05)。体外L929细胞毒性检测显示Gr-SF纳米膜具有良好生物相容性。甲苯胺蓝染色、CCK-8检测及Ed U/Hoechst33342染色示,Gr质量分数在10%以内的Gr-SF纳米膜可支持共培养的雪旺细胞成活和增殖。结论采用静电纺丝技术制备的10%Gr-SF纳米膜具有合适的亲水性、导电性、孔隙率等理化特性,同时具有良好的体外生物相容性,可用于组织工程神经制备。