基于磁微粒的荧光免疫分析法测定人血清中DNA甲基转移酶1

DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferases1,DNMT1)负责维持DNA甲基化遗传稳定性,其表达量与多种肿瘤的发生发展密切相关,是一种重要的肿瘤分子标志物。DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的现有检测方法大多基于原核生物酶建立,且局限于实验室研究,因此建立一种高灵敏、高通量测定人血清中DNMT1含量的荧光免疫分析方法(FLISA),以期为癌症早期筛查及临床应用提供新思路。以Fe3O4磁珠为固相载体,采用碳二亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(EDC/Sulfo-NHS)键合法分别制备磁性免疫捕获探针Fe3O4@DNMT1小鼠单克隆抗体(Fe3O4@McAbDNMT1)及荧光免疫检测探针5-羧基四甲基罗丹明@DNMT1兔多克隆抗体(5-TAMRA@PcAbDNMT1)。用红外光谱、紫外-可见(UV-Vis)光谱、 Zeta电位、免疫活性分别表征偶联产物的结构与活性。在此基础上,采用双抗体夹心法,检测黑色96微孔板中反应产物的荧光强度,根据荧光强度与DNMT1浓度的关系进行定量分析,并进行方法学评价与比较。实验结果显示,双探针偶联成功,并保持了原抗体的免疫活性。该方法的线性方程y=222.046+48.323x,线性范围0.05~80 ng·mL-1,相关系数为0.991 4,检出限为0.005 ng·mL-1,板内、板间的RSD分别为4.7%~8.8%, 1.6%~10.0%(n=6);板内、板间的回收率分别为91.3%~102.4%, 88.0%~98.8%(n=6);方法特异性良好。与酶联免疫吸附法(ELISA)和磁酶免疫吸附法(MELISA)相比, FLISA法的检出限最低,灵敏度最高,所需分析时间最短;FLISA法与商品化ELISA试剂盒对15例人血清样品进行分析,差异无统计学意义(p>0.05)。表明本研究所建立的FLISA方法灵敏快速,适用于大批量人血清样品中DNMT1的快速测定,在临床诊断方面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。