过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的ds RNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体p CAMBIA3300中,构建植物表达载体p CAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子Ca MV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂(500 mg·L-1 Basta)喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T2和T3代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用q RT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦(5 mg·L-1)大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T1—T3代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照(非转基因大豆)植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1—2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11—22.22,较对照(病情指数36.81—46.24)显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。q RT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。

反义RNA介导GmFAD2-1B基因沉默增强大豆种子中油酸的高效累积

油酸含量是评价大豆油食用品质和稳定性的重要指标。本研究采用农杆菌介导转化法,将反义GmFAD2-1B基因导入栽培大豆品种,获得油酸含量显著提高的转基因大豆新品系。Southern杂交检测表明,外源GmFAD2-1B基因片段已导入大豆基因组,其插入拷贝数为1~5个。q RT-PCR检测表明,外源GmFAD2-1B主要在大豆种子中表达,并导致种子中内源GmFAD2-1 m RNA表达水平显著降低,而根、茎、叶、花组织中内源GmFAD2-1 m RNA表达水平无显著变化。脂肪酸组分分析表明,12份转基因大豆种子油酸含量为27.38%~80.42%,其中,L40和L72油酸含量分别为68.91%~80.42%和65.98%~80.22%,较对照品种Williams 82(17.8%~22.0%)提高2.65倍以上,亚油酸降低至4.84%~14.55%,饱和脂肪酸降低至10.34%~11.16%,但总脂肪和总蛋白含量与对照品种相比没有显著变化。农艺性状分析表明,转基因大豆在熟期、株高、叶形、花色、结荚高度、百粒重等方面与对照品种也没有显著差异。

NaCl胁迫下不同抗性野生大豆体内Na^+,K^+,Cl^-浓度比较分析

选取盐敏感型辉南野生大豆和耐盐型通榆野生大豆植物为材料,在5片复叶时期进行了10d的NaCl胁迫处理,测定了根、茎、叶中Na+,K+,Cl-的浓度,以探讨NaCl胁迫下野生大豆体内离子平衡的特点.结果表明:盐敏感型和耐盐型野生大豆植物在NaCl胁迫下,体内Na+和Cl-含量随胁迫浓度增加呈上升趋势,K+含量呈下降趋势.高盐胁迫下,除根部的K+外,其余各部位的Na+,K+,Cl-含量均表现为耐盐型野生大豆低于盐敏感型野生大豆.实验结果证明,通榆野生大豆具有颉颃盐逆境的生理特征和较好的适应性.

不同浓度盐、碱胁迫对野生大豆光合特性和生理生化特性的影响

研究了盐(NaCl)、碱(NaHCO3与Na2CO3按质量比9∶1混合而成)胁迫对辉南野生大豆(盐敏感性)及通榆野生大豆(耐盐型)植株生物量积累、光合特性及某些生理生化特性的影响。结果表明,在盐、碱胁迫条件下,2种野生大豆的生物量均呈下降趋势,叶片的Pn、Gs均呈明显下降趋势。盐胁迫条件下,2种野生大豆的胞间CO2浓度(Ci)呈上升趋势,气孔限制百分率(Ls)呈下降趋势和表观叶肉导度(AMC)呈下降趋势。碱胁迫下,2种野生大豆叶片的Gs、Tr变化趋势与Pn变化趋势基本一致;盐敏感型大豆的Ci随碱浓度升高呈现先增加后降低趋势,Ls呈先降低后增加趋势;耐盐型大豆的Ci随碱浓度升高而升高,Ls呈下降趋势;2种野生大豆的AMC都随碱浓度的增大呈先降后升再下降趋势。盐、碱胁迫下,盐敏感型大豆可溶性糖含量下降明显,而耐盐型大豆变化不大;脯氨酸含量2种野生大豆均积累明显,且盐敏感型大豆积累量高于耐盐型大豆。

RNAi介导SMV-P3基因沉默增强大豆对花叶病毒病的抗性

大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）病是我国各大豆主产区最重要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒外观品质。培育抗病品种是防治该病害最经济有效的措施。本研究基于植物介导RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,将编码参与SMV运动和影响宿主域范围的P3蛋白基因RNAi片段导入栽培大豆品种,研究RNAi介导SMV-P3基因沉默对大豆抗SMV的影响。Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段以低拷贝的形式（1~4个）整合至大豆基因组中。对T_1~T_3代转基因大豆喷施除草剂和PCR鉴定结果表明,外源T_-DNA插入片段在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。对T_2和T_3代转基因大豆接种SMV鉴定结果表明,转基因大豆对我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3较非转基因对照受体品种Williams 82和SN9的抗性水平显著提高,病情指数降低至4.37~18.51,且抗性能够稳定遗传。综上所述,RNAi介导SM-P3基因沉默能够显著提高转基因大豆对SMV的抗性水平。

不同大豆基因型对大豆遗传转化效率的影响及外源T-DNA插入分析

大豆通常被认为是较难转化的豆科作物之一,大豆基因型是影响大豆转化效率的重要因素。采用农杆菌介导大豆子叶节遗传转化方法,对2个国外大豆品种和9个国内品种进行转化研究,对转化再生植株进行BAR试纸条和PCR检测。结果表明：不同大豆品种再生率及转化效率存在显著差异。国外品种Jack和Bert,南方大豆品种华春6号和东北大豆品种沈农9号具有较高的再生率和转化效率,转化效率分别达到6.45%、3.80%、3.24%和2.86%。对来源于沈农9号的PCR阳性植株进行Southern杂交检测,结果表明：外源基因已导入受体大豆品种,该受体品种实际转化效率为2.14%。对外源T-DNA插入结构进一步分析表明：低拷贝（1-2个）T-DNA插入比例为75%。本研究筛选了4个转化效率较高的大豆品种,为开展高效大豆遗传转化研究提供依据;同时,作为大豆主栽品种,利用华春6号和沈农9号作为受体品种开展转基因研究,对于加快转基因大豆新品种培育研究也具有重要的参考价值。

转盾壳霉Cmoxdc1基因增强大豆对菌核病抗性的研究

草酸被认为是核盘菌的主要致病因子,在病原菌的侵染过程中发挥着重要作用,并与核盘菌的致病力密切相关,为研究转盾壳霉草酸脱酸酶基因Cmoxdc1对大豆菌核病抗性的促进作用,本研究利用农杆菌介导转化法,将来源于核盘菌生防菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)的Cmoxdc1基因导入大豆感病品种Jack,研究转Cmoxdc1基因大豆对草酸耐受性和菌核病抗性。结果表明:外源基因以低拷贝形式(1~2个)整合至大豆基因组,并能够完成转录。对离体叶片进行60 mmol·L^-1草酸处理后,转基因植株叶片病斑面积显著低于对照受体品种,接种7 d后病斑面积较受体对照减少88.80%~89.98%。离体叶柄和叶片接种核盘菌后,转基因大豆病斑扩展受到明显抑制,病斑长度和病斑面积均显著低于对照受体。接种4 h后,叶柄病斑长度为对照品种的41.38%~43.51%;接种7 d后,叶片病斑面积为对照品种的8.68%~27.01%;并且,接种核盘菌后转基因叶片中的草酸含量也较对照品种显著降低。研究结果表明盾壳霉Cmoxdc1表达显著增强转基因大豆对草酸的耐受性和对菌核病的抗性。

农杆菌介导大豆子叶节转化cry1Iem基因

利用农杆菌介导法,以东北地区种植的9个大豆基因型和国外品种Williams82的子叶节为外植体,将抗虫基因cry1Iem转入栽培大豆品种中。共转化外植体1 459个,获得84棵再生植株。采用除草剂叶片涂抹法、PCR及Bar蛋白试纸条检测法对得到大豆再生植株进行鉴定,转cry1Iem基因大豆T_0阳性植株为61株。对部分T_1转基因植株的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代。通过对部分T_1阳性转基因植株进行Southern blot分析,证明目的基因片段均已整合到受体大豆的基因组DNA中,单拷贝率为22%左右。对获得的部分T_2材料进行了室内抗大豆食心虫鉴定,有2份转基因材料抗性较对照显著提高。

大豆属Soja亚属不同进化型植物叶片演化结构研究

为了探讨大豆属(Glycine)Soja亚属植物的系统演化规律,采用石蜡切片法对产自吉林省的大豆属Soja亚属4种植物的叶片结构进行显微观察。结果显示,Soja亚属中的野生大豆(Glycine sojaSeib.et Zucc.)、半野生大豆(semi-wild soybean)、半栽培大豆(semi-cultured soybean)、栽培大豆(Glycine max(L.)Merrill.)叶片的部分结构特征差异显著;从野生大豆到栽培大豆,其叶片和主脉逐渐加厚、表皮毛数量增多,主脉维管束中导管分子列数增多且逐渐演化出异型维管束,栅栏组织层数逐渐增多,CTR(栅栏组织/叶片厚)和SR(海绵组织/叶片厚)值也有增高的趋势;栽培大豆栅栏组织最发达,已演化出4层栅栏组织细胞。大豆属Soja亚属4种植物(野生大豆、半野生大豆、半栽培大豆、栽培大豆)叶片间的解剖结构差异表现出明显的进化趋势。

不同生态环境野生大豆叶片结构比较

以耐盐型的通榆野生大豆和盐敏感型的辉南野生大豆植物叶片为试材,应用石蜡切片和植纹鉴定技术,对不同生态环境野生大豆叶片的解剖结构和表观植纹进行比较研究。结果表明,不同生态环境野生大豆叶片解剖结构存在明显差异,通榆野生大豆相对于辉南野生大豆叶片表皮细胞排列整齐,外切向壁角质层较厚,孔下室不明显,机械组织发达,栅栏组织较厚,平脉叶肉细胞多,主脉维管束导管分子较多,且出现异形维管束。植纹鉴定结果表明,尽管不同生态环境生长的野生大豆具有很高的同源相似性,但数理统计后的植纹特征显示出通榆野生大豆表观结构植纹更进化。通榆野生大豆具有拮抗盐逆境的演化结构。野生大豆植纹鉴定结果可为鉴别同属以及不同品系的同种植物提供科学依据。

不同生长环境对栽培大豆叶片某些生理指标的影响

在苗期(V4)、花期(R2)、结荚期(R4)和鼓粒期(R6)对不同生长环境下的8个栽培大豆品种的某些生理指标的测定结果表明:叶绿素含量随生育期的推进呈升高趋势;可溶性糖、可溶性蛋白含量的变化趋势一致,在V4至R2期升高,R2至R4期下降,R4至R6期又升高,其中R4期的值最低;超氧化物歧化酶(SOD)活性在V4至R6期呈持续下降趋势,V4期最高,R6期最低;过氧化物酶(POD)活性呈持续增加趋势,V4期最低,R6期最高;过氧化氢酶(CAT)活性在V4期最低,V4至R2期升高,在R2期的活性达最高,R2至R6期呈下降趋势。研究还发现,黑钙土中各大豆品种的各项指标均高于沙黄土。

杏的抗盐碱结构比较研究

采用光学显微镜技术和石蜡永久制片技术,对长春和白城地区两种不同生态环境的杏Prunus armeniaca L.进行了结构植物学研究.结果表明:白城地区盐碱地生长的杏,与长春地区生长的杏相比,其在形态结构上已发生了适应盐碱胁迫环境的演化.耐盐碱杏的茎、叶柄及叶片在颉颃盐碱逆境中,都演化出了独特的结构,验证了生态环境影响植物体结构建成的理论.

不同生境榆树茎次生维管组织及果实解剖研究

采用石蜡切片与离析方法,对吉林省松原市长岭县5年生的榆树枝条及果实和吉林省长春市长春师范学院院内5年生的榆树枝条及果实进行了解剖特征研究.结果表明,长岭榆树在茎次生木质部、果实和茎次生韧皮部等方面具有特化结构,显示了适应盐碱地的形态结构特征.

转基因技术对提高大豆油脂和油酸含量的作用

植物油脂在人们的日常生活中有着举足轻重的地位,大豆(Glycine max L. Merrill)是我国最重要的油料作物和饲料作物之一,也是人类植物性蛋白和油脂的重要来源。大豆中油脂和油酸的含量均为20%左右。利用生物工程技术手段,对调控脂肪酸合成和积累的关键基因进行编辑和改良,能够提高大豆种子中油分含量或者改善脂肪酸组成,不仅能够加快优质高油、高油酸大豆育种进程,在人类健康方面也具有重要的意义,而且为大豆油成为新能源的发展提供可能。

利用大豆潜力实现可持续农业发展和粮食安全

大豆是牲畜饲料的重要来源,然而气候环境变化对大豆产量、品质和安全影响严重,因此迫切需要培育适应气候变化负面影响的大豆新品种。现代生物技术的发展促进数量性状位点的基因挖掘,通过转基因的方式辅助育种进而培育高产量和高品质的大豆品种。此外,转基因技术还可以用来操纵植物的遗传组成,提高饲料的消化率,从而提高动物的性能。对大豆在提供优质饲料方面的遗传潜力进行了评价。同时探讨了气候变化对饲料质量的影响,并讨论了在增强植物对非生物胁迫条件的适应方面所做的努力。

油莎豆种质资源表型性状遗传多样性分析及综合评价

油莎豆(Cyperus esculentus L.)是一种粮、油、饲兼用,综合利用价值较高的经济作物。种质资源遗传多样性分析及评价是开展油莎豆遗传育种和复杂性状遗传解析的重要基础。本研究以国内外收集的48份油莎豆种质资源为实验材料,对株高、分蘖数、叶宽、块茎长宽比、产量等10个农艺性状进行遗传多样性分析和综合评价。结果表明:48份油莎豆表现出较丰富的遗传多样性(变异系数8.94%~50.3%),其中与地上草产量和地下块茎产量相关的指标如分蘖数、块茎长宽比、百粒重等性状变异程度较高。聚类分析表明,48份油莎豆资源可分为4个类群,第Ⅰ类群包含15个种质,第Ⅱ类群包含5个种质,第Ⅲ类群包含12个种质,第Ⅳ类群包含16个种质。主成分分析和逐步回归分析法综合评判表明,JYD-27,JYD-41,JYD-20的综合性状表现较好,块茎长宽比、百粒重、叶长宽比3个主成分可作为种质资源综合评价指标。

抗病毒转基因大豆事件外源T-DNA序列分析及定性检测

转基因作物的T-DNA插入及其与宿主基因组的连接序列构成的侧翼区域,是转基因事件检测的关键组成部分,也是转基因作物开发、评估和监管所必需的。前期研究得到2个携带大豆花叶病毒P3(soybean mosaic virus P3)基因干扰片段的转基因大豆事件,即L13和L104,可显著提高大豆对大豆花叶病毒、大豆花叶坏死病毒和西瓜花叶病毒的抗性,具有较强的光谱性。为了便于对该转基因事件进行监管以及建立事件特异性检测方法,本研究通过Illumina Xten平台,对L13和L104进行全基因组测序(whole genome sequencing,WGS),并结合生物信息学分析和PCR技术,对转基因事件L13和L104的旁侧序列进行了分析。通过全基因组测序,每一个事件获得了超过12.13 Gb的原始数据,测序深度为11×,与大豆参考基因组(Wm82.a2.v1)和转化载体序列做比较,初步识别出这两个转化事件T-DNA的边界及其旁侧序列。转化事件L13和L104的T-DNA分别位于Chr04和Chr11染色体上。进一步的PCR检测和序列测定表明转基因事件L13的T-DNA为单位点双拷贝整合到大豆基因组Chr04:46747946位点;转基因事件L104的T-DNA为单拷贝插入,整合位点为Chr11:30461895位点。结果证明了全基因组测序在识别转基因作物T-DNA插入和旁侧序列区域方面的有效性和稳定性。此外,插入位点的鉴定和事件特异性检测的建立将有助于广谱抗病毒转基因大豆品种的应用和发展。

油莎豆种质资源苗期抗旱性鉴定与评价

油莎豆(Cyperus esculeutus L.)是一种新型生态经济型作物,开展油莎豆种质资源抗旱筛选与评价可为选育适沙抗旱新品种提供依据。本研究通过室内盆栽试验,测定39份油莎豆种质在正常灌溉和自然干旱胁迫条件下的17个表型和生理指标。采用相关性分析、主成分分析、隶属函数及聚类分析相结合的方法,对油莎豆苗期抗旱性进行综合评价。结果表明:干旱胁迫对油莎豆的叶宽、叶厚和根长具有显著影响(P<0.05),对株高、分蘖数、地上干重、地下干重和总干重具有极显著影响(P<0.01),不同种质材料间的变异系数介于0.148~0.584。5个主成分可以代表原17个指标74.174%的数据量。叶宽、枯叶率、根长、鲜重、干重、根冠比可以作为抗旱评价主要指标。聚类分析可将39份油莎豆种质由强到弱分为4个等级,1~4级分别含有2、10、16、11份种质。抗旱性度量值可作为油莎豆抗旱评价的适宜指标,基于此筛选出苗期抗旱性强的油莎豆种质资源为JYD-39、JYD-34和JYD-28。

耐盐转基因大豆事件FA8015旁侧序列分离及定性PCR检测

本研究前期利用转基因技术,将菠菜(Atriplex hortensis)甜菜碱醛脱氢酶编码基因Ah BADH导入栽培大豆Williams 82中,获得耐盐性较强的转基因大豆事件FA8015。为进一步加快该转基因事件生物安全评价,本研究分离了FA8015外源T-DNA旁侧序列,并依据其序列特征,建立事件特异性检测方法。Southern杂交结果表明,转基因事件FA8015外源T-DNA为单拷贝插入。利用基因组重测序技术,获得转基因大豆事件FA8015的基因组信息,并与参考基因组Williams 82做比较,初步确定转基因大豆事件FA8015外源T-DNA片段整合位点。然后根据整合位点,设计融合大豆基因组和T-DNA序列的引物,获得了1 160 bp的左边界旁侧序列,包括405 bp的大豆基因组序列和750 bp的T-DNA序列;右边界获得了1 254 bp的旁侧序列,其中601 bp为T-DNA片段,653 bp为大豆基因组序列;序列分析证明转基因事件FA8015的T-DNA整合位点为Chr15染色体的25129882位点,整合方式为正向单拷贝插入,与Southern杂交和重测序结果一致。依据PCR结果设计事件特异性引物,建立了转基因大豆事件FA8015转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高,可快速识别该转基因大豆事件的身份,为该转化事件及其衍生品的安全性和监管提供技术支撑。

中国地表城市热岛驱动因素及其空间异质性

基于MODIS卫星遥感数据,计算了中国284个地级市2018年的年平均地表城市热岛强度,分析了中国地表城市热岛的空间分布规律和空间集聚模式.结合多元遥感数据、气象数据和社会经济统计数据,利用地理加权回归模型分析了日间和夜间地表城市热岛强度主要驱动因素的空间异质性.结果表明,中国地表城市热岛强度的空间分布存在明显的空间自相关性;地理加权模型相比传统的普通最小二乘模型,极大地提高了驱动因素的解释程度,日间和夜间的决定系数分别由最小二乘模型的0.659和0.189提高到了0.876和0.651并且具有更低的残差平方和以及赤池信息准则值,从驱动因素来看,除日间的植被因素对地表城市热岛强度的影响显著为负外,其余因素的影响方向均会随着地理位置的改变存在结构性的差异.总体来讲,日间的地表城市热岛强度受城乡植被差异的影响最大,而在夜间则更容易受社会经济因素的影响.