基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组全长S2蛋白IgA抗体ELISA检测方法的建立及应用

【目的】建立一种猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的IgA抗体ELISA检测方法。【方法】以PEDV流行株CH/HNPJ/2017(MF152604.1)为生物材料,通过RT-PCR扩增出S 2基因(2368—4170 bp),并将其插入到原核表达载体pET-24a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,经镍柱纯化。Western blotting验证重组蛋白S2与PEDV阳性血清的反应原性和特异性。将其作为包被抗原,建立一种基于PEDV变异毒株重组全长S2蛋白的IgA抗体ELISA方法,用棋盘法确定该方法的最优检测条件,对其敏感性、特异性和重复性进行测定,并初步应用于130份猪血清和40份猪口腔黏液的检测。【结果】通过RT-PCR方法扩增出S 2基因,成功构建重组表达载体pET-24a-S2,转化大肠杆菌经诱导表达纯化后获得重组S2蛋白。SDS-PAGE结果显示,纯化的S2蛋白条带特异且无杂带;Western blotting试验表明该蛋白与PEDV阳性猪血清具有良好的反应性。ELISA方法反应条件优化结果显示,重组S2蛋白的最佳包被条件为每孔0.5μg、4℃过夜包被;血清最佳反应条件为1∶160稀释,37℃孵育60 min;酶标二抗最佳反应条件为1∶5000稀释,37℃反应30 min;TMB最佳显色时间为室温下10 min。待检样品S/P值≥0.04时为阳性,S/P值≤0.02时为阴性,S/P值介于0.02~0.04之间为可疑。利用本试验建立的ELISA方法检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪德尔塔冠状病毒标准阳性血清,S/P值均<0.02,显示为阴性,说明该方法具有良好的特异性;将PEDV阳性血清进行640倍稀释时利用该方法检测仍为阳性,说明该方法具有良好的敏感性;利用该方法进行批间批内试验,变异系数均小于8%(在10%以内),表明该方法具有良好的重复性。利用该方法检测保存的130份猪血清,结果与IDEXX IgA抗体检测试剂盒的符合率为90.77%;该方法对40份猪口腔黏液的检测结果表明,阳性检出率为90.0%,阴性检出率为为93.3%。【结论】本研究成功构建pET-24a-S2重组质粒,获得纯度较高的重组S2蛋白,并以此作为包被蛋白建立了基于全长S2蛋白IgA抗体ELISA检测方法。该方法能同时有效检测血清和口腔黏液样本,且敏感性强、特异性高、稳定、重复性好,该方法对PEDV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。

猪圆环病毒同义密码子的使用模式及其影响因素

[目的]揭示猪圆环病毒(PCV)基因组的进化特点和遗传多样性。[方法]通过计算PCV基因组的相对同义密码子使用频率(RSCU)、有效密码子数目(ENC)和核苷酸含量等指标,对PCV基因组的密码子使用模式进行了综合分析。[结果]PCV基因组具有较低的GC含量和低的密码子偏好性,不同基因型的PCV在密码子使用上具有显著差异,并且PCV与圆环病毒科中的其他病毒的密码子使用模式也存在差异。PCV与其宿主的密码子使用模式存在一定程度的相似性。此外,地理因素、蛋白质总的平均疏水性和芳香性等可能与PCV的密码子使用模式的形成有关。[结论]PCV基因组的密码子使用模式的形成是突变压力与自然选择相互作用的结果。该研究对阐明PCV的密码子使用规律以及分子进化过程提供了最新的信息。

A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列的测定及其基因特征分析

[目的]测定A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列并分析其基因特征,为研究我国最近发生的A型口蹄疫病毒的致病性、流行规律以及筛选适用的疫情防控疫苗株奠定分子基础。[方法]应用RT-PCR方法,分段扩增、克隆A/HeN/1/2009株基因,并进行基因测序;借助DNAStar分子生物学软件,从分子流行病学角度分析A/HeN/1/2009株与参考毒株之间可能的遗传衍化关系。[结果]该毒株基因组全长8 171 nts[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],其中5'-UTR和3'-UTR分别为1 080、92 nts,蛋白编码区为6 999 nts。分析A/HeN/1/2009株遗传衍化关系显示,该毒株划为东南亚拓扑型Laos03系的VN09亚系,同源性依次为87.3%～91.8%、93.7%～94.5%和96.9%～98.4%。[结论]VP1中A24V、N85R、S196T,3A中I61V、T128S、E147G和A134V在该毒群的进化过程中扮演重要角色;A/SH/1/2009株VP1 140-160基序为RSD。