节律分子BMAL2对急性髓系白血病细胞有氧糖酵解和细胞增殖的影响

目的:了解类芳烃受体核转位蛋白2(BMAL2)在急性髓系白血病(AML)中的表达及与患者预后的关系,分析其对AML细胞有氧糖酵解和增殖的影响。方法:应用实时定量PCR法检测AML患者和正常对照组的骨髓单个核细胞中BMAL2的表达情况。利用美国国家生物技术信息中心公共数据库分析BMAL2表达与AML患者预后的相关性。通过慢病毒系统敲低AML细胞系HL-60和Kasumi-1中BMAL2的表达,葡萄糖摄取实验、乳酸含量实验、CCK-8法、细胞集落形成实验检测其对细胞糖代谢、细胞增殖的影响。结果:BMAL2 mRNA在AML中的表达水平显著高于正常对照组(P<0.01)。BMAL2表达高的AML患者总生存时间较低表达患者明显缩短(P<0.05)。敲低AML细胞系HL-60和Kasumi-1中的BMAL2后,细胞葡萄糖摄取减少,乳酸生成减少。RT-PCR及Western blot检测结果显示,BMAL2通过增强HIF1A的表达来促进AML细胞有氧糖酵解,进而促进细胞增殖。结论:BMAL2高表达于AML中,通过HIF1A增强AML细胞有氧糖酵解从而促进细胞增殖。

敲除BMAL1基因促进HL-60细胞凋亡并抑制增殖

目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除节律基因BMAL1的HL-60细胞系,探讨BMAL1分子在人急性髓系白血病中的生物学功能。方法:针对BMAL1基因设计2条sg RNA,构建含有sg RNA的PX459敲除载体;应用T7核酸内切酶I检测设计的sg RNA活性;应用打靶载体瞬时转染HL-60细胞构建BMAL1敲除细胞系,应用Western blot检测BMAL1蛋白的表达,应用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平,应用CCK-8试剂盒检测敲除细胞系的增殖能力。结果:成功构建了针对BMAL1的PX459-sg RNA载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体。Western blot实验在敲除细胞中未检测到BMAL1蛋白的表达。进一步实验发现,BMAL1敲除的HL-60细胞凋亡水平明显升高,细胞增殖能力明显减弱。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了BMAL1基因敲除的HL-60细胞系,并发现BMAL1敲除可以促进HL-60细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,初步揭示了BMAL1生物节律基因在急性髓系白血病中的生物学作用。

奥曲肽对重症急性胰腺炎大鼠枯否细胞m2极化功能的调节作用

目的探讨生长抑素类似物奥曲肽对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠枯否细胞(Kupffer cells)m2极化功能的调节作用。方法采用经胰管逆行注射5%牛黄胆酸钠和0.9%NaCl分别建立大鼠重症急性胰腺炎模型和对照组模型。36只SD大鼠随机分为六组:假手术组(S)、SAP组、奥曲肽治疗组(ST)、生理盐水治疗组(NT)、奥曲肽预防组(SP)、生理盐水预防组(NP),分别于造模后24 h处死,胶原酶Ⅳ体内灌注肝脏,采用25%、50%Percoll液密度梯度离心法提取肝Kupffer细胞。Elisa检测血清中TNF-ɑ、IL-4、IL-10水平,RT-PCR检测肝Kupffer细胞内极化水平,即TNF-ɑ、IL-4、IL-10的表达,HE染色观察胰腺组织病理损伤情况。结果 (1)SAP组、生理盐水治疗组和预防组血清中TNF-ɑ的水平明显升高,与奥曲肽治疗组相比差异显著(P<0.05或0.01),与奥曲肽预防组比较并无明显差异。奥曲肽治疗组和预防组IL-4水平明显增高,与其他组相比有显著差异(P<0.01),而其两组之间IL-4水平无差异。IL-10水平在奥曲肽治疗组明显升高,与SAP组、生理盐水治疗组和预防组相比差异显著(P<0.01),而IL-10水平在奥曲肽预防组并未见明显升高,与奥曲肽治疗组相比有明显差异(P<0.05)。(2)肝脏Kupffer细胞中,与假手术组相比,TNF-ɑ在SAP组的表达明显上升(P<0.01),而在奥曲肽治疗组和预防组的表达明显降低,与假手术组、SAP组比较差异显著(P<0.01)。IL-4的表达量在SAP组明显下降,与假手术组相比差异显著(P<0.01),而在奥曲肽治疗组和预防组的表达量明显上升,与SAP组、生理盐水治疗组和预防组相比差异显著(P<0.05或0.01)。SAP组与假手术组相比,IL-10的表达量显著降低(P<0.01),而其表达量在奥曲肽治疗组和预防组明显升高,与假手术组、SAP组、生理盐水治疗组和预防组相比差异明显(P<0.01或0.05)。(3)SAP组、生理盐水治疗组和预防组胰腺组织出血、水肿、坏死明显,奥曲肽治疗组和预防组胰腺组织炎症明显减轻。结论肝Kupffer细胞在SAP病情发展中起着重要作用,奥曲肽通过影响其中TNF-ɑ、IL-4和IL-10的表达和分泌,从而调节Kupffer细胞m2极化功能,对SAP具有一定的治疗作用。

MCUR1在多发性骨髓瘤中的作用

目的探讨线粒体钙单向转运体调节分子1(MCUR1)在多发性骨髓瘤(MM)患者中的表达变化,观察其对MM细胞周期、凋亡的作用,初步分析其内在分子机制。方法设瞬时转染MCUR1干涉片段1和2的人MM细胞系RPMI 8226细胞作为实验组(命名为si MCUR1-1和si MCUR1-2细胞),阴性干涉片段转染的RPMI 8226细胞(命名为si Ctrl细胞)作为对照组;实时定量PCR测定MCUR1在MM患者及正常对照者骨髓单个核细胞中的表达水平;实时定量PCR和Western blot检测MCUR1沉默效果;用CCK-8法和流式细胞计量术分别测定沉默MCUR1后细胞增殖、细胞周期和凋亡,Western blot检测MCUR1沉默后p53及其下游分子表达变化。结果与对照者相比,MCUR1在MM患者中的表达显著升高(P<0. 05); MM细胞系RPMI 8226中干扰MCUR1后,与对照组相比,细胞增殖显著减慢(P<0. 05),G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,细胞凋亡比例增加;与对照组相比,干扰MCUR1组细胞内p53、BAX蛋白表达增加,BCL2、cyclin D1和cyclin E蛋白表达减少。结论 MCUR1在MM患者中表达上调,MCUR1通过抑制p53通路进而促进MM细胞增殖。

地西他滨联合减量IAG方案治疗中高危骨髓增生异常综合征及其转化急性髓系白血病的临床观察

目的:分析国产地西他滨联合减量IAG方案[粒细胞集落刺激因子(G-CSF)+伊达比星(IDA)+阿糖胞苷(Ara-C)]在治疗骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)及其转化急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中的临床疗效及其安全性。方法:选取2014年10月至2016年5月收治的中高危MDS以及AML(MDS转化)患者共20例,应用国产地西他滨联合减量IAG方案治疗,观察临床疗效及不良反应发生情况。结果:20例患者至少进行2疗程化疗,完全缓解者9例,部分缓解5例,总有效率为70%(14/20)。所有患者均出现III-IV级血液学毒性,第1、2疗程粒细胞缺乏及III、IV级血小板减少持续时间无统计学差异(P>0.05)。年龄≥60岁患者粒细胞缺乏时间更长,与年龄<60岁患者相比差异有统计学意义(P<0.05),所有患者非血液学不良反应均可耐受。染色体核型预后良好者疗效佳,预后不良者预后差,患者的年龄、性别与疗效无显著相关性。结论:地西他滨联合减量IAG方案治疗MDS和AML疗效显著,不良反应可控,耐受性较好,值得在临床上进一步推广。

生物钟昼夜节律调节基因(CLOCK)在肝癌中高表达且与预后不良相关

目的明确生物钟昼夜节律调节基因(CLOCK)在肝细胞肝癌(HCC)中的表达及对细胞生长的作用。方法采用免疫组织化学染色法检测CLOCK在158例HCC组织及对应癌旁组织中的表达,利用HCC公共数据(共356例)验证CLOCK在HCC组织中的表达变化。单因素统计分析CLOCK表达与HCC患者临床病理特征间的关系,并且采用生存分析法比较CLOCK表达水平高低对HCC患者生存的影响。敲低肝癌Hep G2细胞中CLOCK水平,采用MTS法检测CLOCK对细胞生长的影响。结果 CLOCK在HCC组织高表达,而在356例HCC公共数据中,癌组织中CLOCK表达同样显著上调。按照CLOCK的表达水平,将158例HCC患者分为低表达组和高表达组,单因素分析结果显示,CLOCK在HCC中的表达与肿瘤直径、TNM分期、门脉侵袭有关。CLOCK低表达组HCC患者的总生存时间和无复发生存时间均显著长于高表达组患者。在肝癌Hep G2细胞中,敲低肝癌细胞CLOCK后细胞增殖能力显著降低。结论 CLOCK在HCC中呈高表达趋势,与HCC的恶性程度相关,其表达上调提示HCC患者预后不良,敲低CLOCK显著抑制肝癌细胞生长。

CLAG方案和MEA方案治疗复发/难治急性髓系白血病的疗效比较

目的:探讨CLAG方案(克拉屈滨+阿糖胞苷+重组人粒细胞刺激因子)和MEA方案(米托蒽醌+依托泊苷+阿糖胞苷)在治疗难治/复发急性髓系白血病(RR-AML)患者中的疗效及其安全性,并分析在难治性AML患者中应用两种方案的优劣性,为RR-AML的治疗提供依据。方法:回顾性分析44例RR-AML患者,比较CLAG组(n=20)和MEA组(n=24)临床疗效,并观察两种方案的不良反应发生情况,进一步比较CLAG方案和MEA方案在治疗20例难治性AML患者中的临床疗效。结果:CLAG组患者的完全缓解(CR)率40.0%(8/20)高于MEA组29.2%(7/24),但是两组之间比较,差异并无统计学意义(χ~2=1.104,P=0.766);CLAG组患者中位无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)均优于MEA组,并且差异性显著有统计学意义(χ~2=6.834,P=0.004;χ~2=6.883,P=0.001);CLAG组肺部感染发生率较MEA组高,且差异有统计学意义(χ~2=8.826,P=0.033),粒细胞缺乏发生率亦高于MEA组,但差异无统计学意义(P>0.05)。难治性AML患者CLAG方案治疗的中位OS、PFS均优于MEA方案治疗患者,但差异均无统计学意义(χ~2=1.037,P=0.820;χ~2=0.463,P=1.000)。结论:CLAG方案可作为RR-AML患者一线挽救治疗方案,不良反应可控,以期再次达到CR,获得造血干细胞移植机会。

地西他滨联合小剂量HAG方案治疗老年急性髓系白血病疗效研究

目的:观察国产地西他滨联合小剂量HAG方案治疗老年急性髓系白血病的疗效及不良反应。方法:回顾性分析我中心2014年4月至2016年12月收治的80例老年急性髓系白血病患者的临床资料,依据用药方法不同分成观察组和对照组,观察组采用国产地西他滨联合小剂量HAG方案治疗,对照组采用传统MA方案治疗。观察两组患者的疗效及不良反应发生情况。结果:观察组患者接受国产地西他滨联合小剂量HAG方案治疗后的完全缓解率及部分缓解率均显著高于对照组(P<0.05);化疗后粒细胞缺乏时间以及肺部感染发生率明显低于对照组(P<0.05);两组化疗方案所致肝肾毒性、消化道反应等非血液学不良反应均可耐受,无统计学差异(P>0.05)。结论:国产地西他滨联合小剂量HAG方案治疗老年急性髓系白血病有效率较高,不良反应较轻,安全性高,临床值得推广。

CLAG方案治疗复发难治急性髓系白血病的疗效观察

目的:评价CLAG方案(2-CdA+Ara-C+G-CSF)治疗复发难治急性髓系白血病的疗效及安全性。方法:回顾性分析我中心2015年6月至2016年8月应用CLAG方案治疗的12例复发难治急性髓系白血病患者。结果:12例患者均系复发难治急性髓系白血病,根据NCCN急性髓系白血病指南(2017年第1版)细胞遗传学及分子生物学标记,进行危险度分级,其中预后良好组3例,预后中等组5例,预后不良组4例。所有患者均给予1疗程CLAG方案化疗,其中8例(72.7%)达到完全缓解(CR),2例(18.2%)达到部分缓解(PR),总有效率(OR)90.9%。所有患者均出现Ⅲ-Ⅳ级血液学毒性,主要毒副反应为粒细胞缺乏及血小板减少所导致的感染和出血,其中肺部感染8例(72.7%),侵袭性真菌病5例(45.5%),革兰阴性杆菌败血症2例(18.2%)。6例患者(54.5%)发生Ⅲ-Ⅳ级出血,1例因弥漫性肺泡出血早期死亡。化疗所致恶心呕吐、肝肾毒性、口腔黏膜炎等非血液学毒性均为Ⅰ-Ⅱ级。结论:CLAG方案治疗复发难治性急性髓系白血病有效率较高。化疗所致骨髓抑制较重,但合并感染、出血可控制,非血液学毒性轻微,安全性较好,可作为复发难治急性髓系白血病挽救性治疗的首选方案。

EMRE在小鼠心肌缺血损伤中的作用及其相关机制的研究

目的:研究调节线粒体钙单向转运体活性所必须的蛋白(essential MCU regulator,EMRE)在小鼠心肌缺血损伤中发挥的作用及其相关机制。方法:利用心肌点注射EMRE腺病毒(Ad-EMRE)上调心肌组织的EMRE分子表达水平,对照小鼠心肌点注射增强绿色荧光蛋白腺病毒(Ad-eGEP),48 h后,采用结扎小鼠左冠状动脉前降支方法建立心肌梗死(MI)模型。实验设置三组:假手术组(给予Ad-eGFP);心肌梗死对照组(给予Ad-eGFP);心肌梗死处理组(给予Ad-EMRE)。三周后,利用小动物超声系统测定小鼠心脏功能;Western blot及免疫组化检测EMRE分子的表达;麦胚凝集素(WGA)染色检测心肌细胞肥大程度;马松(MASSON)染色检测心肌组织胶原含量;原位末端标记法(TUNEL)检测心肌组织的细胞凋亡;Western blot检测心肌组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的表达;MitoSOX荧光探针检测线粒体ROS水平。结果:与心肌梗死对照组相比,心肌梗死处理组的心功能明显变差,心肌肥厚明显加重,心肌组织胶原纤维含量更高。另外,心肌梗死处理组的心肌细胞凋亡明显增多,Caspase-3和Caspase-9表达明显升高,线粒体活性氧簇产生也明显增多。结论:EMRE过表达可增加线粒体ROS生成,诱导心肌细胞凋亡,加重心肌缺血损伤。

成人重症原发免疫性血小板减少症的治疗分析

目的分析成人重症原发免疫性血小板减少症(ITP)的临床治疗方案及不良反应。方法回顾性分析2017年1月至2018年12月西安市中心医院收治的31例成人重症ITP患者的临床资料,分成地塞米松联合血小板生成素(TPO)治疗组(地塞米松组,16例)和免疫球蛋白联合TPO治疗组(静注人免疫球蛋白组15例),对比两组患者的临床有效率。结果地塞米松联合TPO组治疗有效率为93.75%,其中完全反应(CR)率为68.75%,1例患者治疗无效;免疫球蛋白联合TPO治疗组有效率为100.00%,其中CR率为73.33%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论静注人免疫球蛋白联合TPO治疗组与地塞米松联合TPO治疗组疗效接近。

造血干细胞移植后侵袭性真菌病临床特点及危险因素分析

目的探讨血液病患者造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)术后侵袭性真菌病(invasive fungal disease,IFD)的临床特点,分析HSCT后发生IFD的危险因素。方法收集2016-2018年重庆医科大学附属第一医院血液科采用HSCT的血液病患者233例临床资料,包括年龄、基础疾病、并发症、粒细胞缺乏时间等,分析并了解HSCT患者发生IFD的临床特点及危险因素。结果233例HSCT患者有41例发生IFD,其中确诊7例,临床诊断34例,总发生率为17.6%,病死率46.3%。在41例确诊/临床诊断的IFD中,突破性侵袭性真菌病(breakthrough invasive fungal disease,bIFD)共32例,占78.0%,总发生率为13.7%,病死率为51.5%。移植前IFD的疗效影响移植后IFD的发生率。41例IFD患者中,19.5%为侵袭性念珠菌病,80.5%为侵袭性霉菌病;血流感染占17.1%,肺部感染占82.9%。检出的病原菌中以非白色念珠菌为主。单因素分析显示异体移植、移植前IFD史、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染、EB病毒感染、肺部基础疾病、粒细胞缺乏>14 d、大剂量激素的使用是IFD发生的危险因素;多因素分析显示移植前IFD史、EB病毒感染、肺部基础疾病、粒细胞缺乏>14 d、大剂量激素的使用为IFD的独立危险因素。在异基因造血干细胞移植患者中,多因素分析显示慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)也是IFD发生的独立危险因素。在确诊/临床诊断的IFD中,bIFD的独立危险因素为粒细胞缺乏>14 d。结论造血干细胞移植后侵袭性真菌病的发生率、病死率高,且突破性IFD比例较高。HSCT后IFD以侵袭性霉菌病为主,肺部感染多见。移植前合并IFD史、EB病毒感染、合并肺部基础疾病、粒细胞缺乏>14 d、大剂量激素的使用增加HSCT后IFD的发生风险。慢性移植物抗宿主病增加异基因造血干细胞移植后IFD的发生风险。

Survivin基因调控Notch1信号通路抑制骨髓瘤细胞增殖及侵袭的机制

目的探讨Survivin基因调控Notch1信号通路对骨髓瘤细胞增殖及侵袭的影响。方法 RT-PCR检测42例骨髓瘤组织及正常骨髓组织中Survivin基因的m RNA表达;NC-si RNA和Survivin-si RNA转染人骨髓瘤细胞株RPMI8226,Western blot检测48 h后各组细胞中Survivin蛋白的表达;台盼蓝拒染法和Transwell小室分别检测细胞活率及侵袭能力;Western blot检测MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白的表达。结果 Survivin基因在骨髓瘤组织中的m RNA表达显著高于正常骨髓组织(P﹤0.01);转染si RNA后RPMI8226细胞中Survivin蛋白的表达显著降低(P﹤0.01);与对照组及NC-si RNA组的比较,Survivin-si RNA组细胞活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表达均显著降低(P﹤0.01)。结论 RNA干扰Survivin基因的表达可降低RPMI8226细胞活率及侵袭能力,其机制与抑制Notch1信号通路有关。

节律基因NPAS2在急性髓系白血病中的表达及对细胞生长的影响

目的探讨神经元PAS结构域蛋白2(neuronal PAS domain protein 2,NPAS2)在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者和细胞系中的表达变化,及其对AML细胞生长的作用。方法收集陕西省西安市中心医院血液病研究所2013—2017年收治的初诊急性髓系白血病患者46例,实时定量PCR方法检测NPAS2在AML患者及正常对照组骨髓单个核细胞中的表达,Western blot方法检测AML细胞系及对照组中NPAS2的表达;统计学方法分析NPAS2表达高低对AML患者预后的影响;RNAi方法干扰AML细胞内NPAS2表达,利用CCK-8法检测NPAS2对细胞生长的作用。结果 NPAS2在AML患者及细胞系中的表达较对照组升高(P<0.05);在M1、M2、M3、M4、M5患者中NPAS2表达较对照组升高(P<0.05),在M6和M7患者中其表达较对照组差异无统计学意义(P>0.05);高表达NPAS2的AML患者其总体生存期较低表达患者短(P<0.05);AML细胞中干涉NPAS2后,与对照组比,干涉组细胞生长明显减慢(P<0.05)。结论 NPAS2在AML患者中表达上调并与AML患者预后负相关,同时NPAS2促进AML细胞生长。

替考拉宁治疗血液病感染及革兰阳性菌脓毒血症患者的疗效与安全性评价

目的评价替考拉宁治疗血液科病房中性粒细胞缺乏症合并感染以及革兰阳性菌脓毒血症患者的疗效及安全性,为临床诊疗提供依据。方法选取2013年10月-2016年9月医院血液科158例中性粒细胞缺乏合并感染住院患者,其中革兰阳性菌脓毒血症患者38例,给予替考拉宁注射液治疗,疗程5~14d,评价其临床疗效及安全性。结果 158例患者临床治愈101例,显效22例,总有效率为77.8%,不良反应率为3.2%,感染部位以呼吸道为主;急性白血病患者合并脓毒血症发生率较多发性骨髓瘤、淋巴瘤患者的发生率高,差异有统计学意义(P<0.05);38例革兰阳性菌脓毒血症患者中以金黄色葡萄球菌、屎肠球菌感染最为多见;死亡患者的PCT、hsCRP较非死亡患者显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论替考拉宁是一种高效、作用迅速的糖肽类抗菌药,其治疗血液科病房中性粒细胞缺乏合并感染患者疗效确凿,临床安全性高,是经验性治疗的理想药物;联合检测血清PCT、hsCRP对脓毒血症患者的临床诊断、治疗及预后判断具有重要意义。

血栓预防策略及研究进展

近年血栓性疾病发病率有渐增之势,其已成为主要疾病负担,也是导致人类死亡的主要原因之一。抗凝药预防和治疗血栓性疾病的有效性已得到临床证实,但抗凝治疗是一把双刃剑,一方面可降低血栓事件发生率,另一方面则会导致出血并发症,而精准抗凝治疗可以确保血栓性疾病患者更多获益。本文主要综述了血栓形成的机制、血栓预防的现状及研究进展,以期为血栓性疾病患者制定合理的临床决策提供参考。

节律基因CRY1在肝癌中的表达及对肝癌细胞生长的作用

目的:探讨节律基因CRY1(cryptochrome circadian clock 1)在肝癌组织中的表达情况及对肝癌细胞生长的作用。方法:利用实时荧光定量PCR、Western blotting及免疫组织化学染色法,检测CRY1在肝癌组织及细胞中的表达;利用肝癌公共数据信息,分析和验证CRY1在肝癌组织中的表达;真核表达质粒将肝癌细胞CRY1过表达后,采用MTS和Annexin V-FITC/PI双染法,分别检测CRY1对细胞增殖和凋亡的影响。结果 CRY1在癌组织中阳性率为57.5%(23/40),癌旁组织中阳性率为87.5%(35/40),癌中CRY1表达低于癌旁的占80%(32/40),与癌旁组织比较,CRY1蛋白在肝癌组织中的表达明显降低,差异有统计学意义(t=7.53,P<0.001)。CRY1在3个肝癌公共数据信息显示,与对应癌旁组织相比,其在癌组织中表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(TCGA:413.62 vs 335.17,P=0.0155;GSE22058:397.67 vs 360.08,P=0.0207;GSE25097:1.627 vs 1.433,P<0.0001)。同时CRY1在被检测的4株肝癌细胞系中表达也显著低于永生化的正常肝细胞。与对照组比,过表达CRY1组细胞增殖能力明显降低,两组间差异有统计学意义(1.100 vs 0.662,P<0.0001);与对照组比,过表达CRY1组细胞凋亡显著增加(凋亡细胞百分比:7.9 vs 17.5,P=0.0014)。结论:节律基因CRY1在肝癌中低表达,同时CRY1抑制肝癌细胞增殖和促进细胞凋亡。

NPAS2基因敲除的HepG2细胞系构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建生物节律基因NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系,并初步探讨NPAS2基因敲除对肝癌细胞凋亡的影响。方法:利用sgRNA在线设计工具,针对NPAS2设计两条sgRNA;利用PX459质粒构建分别含有两条sgRNA的敲除载体PX459-sgRNA1;PX459-sgRNA2;利用T7核酸内切酶I检测两条sgRNA活性;将活性较高的打靶载体瞬时转染HepG2细胞,经过药物筛选,克隆化培养及基因测序后得到NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系;利用Western blot检测NPAS2蛋白的表达和凋亡相关蛋白Caspase3的活化;利用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平。结果:成功构建了针对NPAS2的打靶载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体;经过药物筛选和克隆化培养得到的NPAS2敲除肝癌细胞系未检测到NPAS2蛋白的表达;进一步发现NPAS2敲除的肝癌细胞Caspase3明显活化,凋亡水平显著升高。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了NPAS2基因敲除的HepG2肝癌细胞系,并发现NPAS2敲除可以促进肝癌细胞凋亡,为进一步研究生物节律基因NPAS2及其它相关基因在肝癌发生发展中的作用机制提供了有力的工具。

microRNA21对人骨髓增生异常综合征细胞株增殖和凋亡的影响

目的:研究micro RNA21(miR-21)对人骨髓增生异常综合征转白血病细胞株SKM-1增殖和凋亡的影响。方法:通过构建携带miR-21基因重组慢病毒干扰载体感染SKM-1细胞株,下调miR-21的表达,荧光显微镜下观察感染效率。体外设LV-miR-21干扰组(LV-miR-21-si RNA组)、阴性对照组(negative control组)和空白对照组(normal组)三组。然后采用q RT-PCR的方法检测各组细胞miR-21的相对表达量,通过CCK8法检测细胞增殖情况,Hoest 33258分析各组细胞的凋亡情况,并运用western blot检测凋亡通路中cleaved-caspase-3、Bax关键因子的表达。结果:通过慢病毒介导的miR-21-si RNA下调miR-21的表达后,q RT-PCR检测结果显示LV-miR-21-si RNA组中miR-21的表达量较negative control组、normal组表达量明显降低(P<0.05);CCK8结果显示LV-miR-21-si RNA组细胞增殖能力与negative control组、normal组比较明显下降(P<0.05),Hoechst 33258结果显示LV-miR-21-si RNA组细胞较negative control组、normal组凋亡增加(P<0.05);western blot证实cleaved-caspase-3、Bax在LV-miR-21-si RNA组中的表达明显升高(P<0.05)。结论:miR-21在骨髓增生异常综合征转白血病细胞株SKM-1中高表达,通过下调miR-21的表达可以抑制SKM-1细胞增殖,促进其凋亡;miR-21可能在骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病转化进程中起重要作用。

CRY2分子对肝癌细胞生长和转移的影响

目的:探讨节律分子CRY2(cryptochrome circadian clock 2)在肝细胞肝癌(HCC)中的表达和对肝癌细胞生长、转移的影响。方法:利用免疫组织化学染色法,分析65例HCC组织中CRY2分子的表达;利用233例HCC公共数据验证CRY2分子在HCC组织中的表达变化;实时定量PCR和Western blot检测肝癌细胞中CRY2的表达。MTS法和Transwell法,分别检测CRY2对肝癌细胞生长和转移的影响。结果:对照组CRY2阳性率为87.7%(57/65),而在肝癌组织中49.2%(32/65)CRY2阳性,CRY2在HCC组织中的表达显著低于对照组,差异有统计学意义(t=10.61,P<0.0001)。233例HCC公共数据(GSE14520)中,癌组织CRY2表达显著下调,差异具有统计学意义(6.663 vs 6.160,P<0.0001)。4株肝癌细胞株中CRY2表达与正常肝细胞株相比,CRY2表达同样显著下调。在肝癌SMMC-7721和Hep 3B细胞中,与对照组比,过表达CRY2组细胞生长能力显著降低,差异有统计学意义(SMMC-7721:0.899 vs 0.473,P<0.0001;Hep 3B:0.785 vs 0.435,P<0.0001)。在肝癌SMMC-7721和Hep 3B细胞中,过表达CRY2组细胞侵袭能力显著降低(SMMC-7721:侵袭细胞数216.33 vs 62.33,P=0.001;Hep 3B:侵袭细胞数169.67 vs 52.33,P=0.015);结论:CRY2分子在HCC中表达下调,同时高表达CRY2会抑制肝癌细胞生长和转移。