实时荧光定量聚合酶链反应检测人锌指蛋白23方法的构建

目的建立检测人锌指蛋白23(human zinc finger 23,ZNF23)的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术。方法采用Primer Express Versions 3.0设计引物及TaqMan探针,检测ZNF23基因。将扩增的ZNF23基因片段纯化后与pMD19-T载体连接,克隆构建含ZNF23基因片段的重组质粒,作为定量检测ZNF23基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为ZNF23特异性片段。本法灵敏度为650 copies/μL,线性范围为(6.50×102)-(6.50×107)copies/μL,相关系数R2为0.999,扩增效率E为97.28%,批间变异系数为0.78%～7.53%。结论成功建立了检测人ZNF23的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、通量高。

Cystatin M在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的了解cystatin M在乳腺肿瘤中的表达及其临床意义。方法采用实时定量PCR检测52例乳腺肿瘤标本及邻近正常乳腺组织中cystatin M mRNA及内参GAPDH表达水平,分析cystatin M基因表达与临床病理参数的关系。结果乳腺癌标本的cystatin M含量与其周围邻近的正常乳腺组织及良性肿瘤中表达cystatin M含量无统计学意义;但发生淋巴结转移的乳腺肿瘤标本的cystatin M则明显低于其周围邻近的正常乳腺组织(P<0·05),也明显低于未发生淋巴结的乳腺肿瘤标本(P<0·05);乳腺癌标本cystatin M表达水平与乳腺癌病人的雌激素受体状态(ER)及孕激素状态(PR)无关。结论Cystatin M是一种监测乳腺癌是否发生转移的一种可靠的指标。

Realtime-PCR动态检测巨细胞病毒在肾移植术后的临床应用

目的探讨巨细胞病毒(C M V)D N A检测在肾移植术后C M V病预防中的作用。方法采用R ealtim e-PC R定量检测肾移植受者外周血白细胞中C M V-D N A,术后4月内每周1次。结果95例患者中有55例检出C M V-D N A阳性(57.9%),初次检出C M V-D N A的平均时间为(25.6±16.3)d,C M V-D N A的平均拷贝数为(1396.4±445.2)/105白细胞。在随访过程中,18例患者的C M V-D N A水平超过警戒线—800copy/105白细胞,经调整免疫抑制剂后,均降至警戒线以下,所需平均时间为(16.3±8.5)d。所有患者均未出现C M V病。结论C M V-D V A检测可用于预防肾移植术后C M V病的发生。

肾移植受者外周血循环中pp65阳性内皮细胞的新模式

目的 :为观察感染人类巨细胞病毒 (HumancytomegalovirusHCMV)的 1例女性肾移植受者外周血中膨大内皮细胞 (Cytome galicendothelialcells ,CEC)的一种新模式。方法 :本研究运用了HCMVpp65抗原分析法、实时PCR技术、流式细胞分析法等系列技术。结果 :发现在一围绕并粘附了许多白细胞的蛋白样物质内 ,含有几个pp65阳性的CEC。这种蛋白质样物质的成分和功能目前还不清楚。该患者外周血中出现CEC表明其血管有损伤 ,而且该患者的CD4+ 及CD8+ 淋巴细胞的百分比都超出正常范围。其血浆、外周血白细胞及尿液中的HCMV DNA都阳性 ,但该患者并没有明显的HCMV病症状。结论 :HCMV感染和CEC形成之间的关系需进一步研究。

用套式PCR对泌尿生殖道生殖支原体感染现状的检测

目的:了解泌尿生殖道生殖支原体的感染状况。方法:采用套式 PCR 对临床正常者46例(女26,男20)和泌尿生殖道炎症患者142例,(男49、女93),进行生殖支原体的检测。结果;(1)临床正常男女性泌尿生殖道生殖支原体的检出率为4.3%(2/46)。(2)泌尿生殖道炎症患者的检出率为40.8%(58/142),其中合并 NG、CT、或 UU 感染率占23.2%(33/142),单纯生殖支原体感染率占17.6%(25/142)。结论:泌尿生殖道有生殖支原体的寄居;生殖支原体的感染是泌尿生殖道炎症的病因之一。

Real-Time PCR监测巨细胞病毒在肾移植中的应用

目的 :推荐一种快速、敏感、特异的可以早期诊断肾移植受者并发巨细胞病毒 (Cytomegalovirus,CMV)感染的检测技术。方法 :使用实时在线荧光定量PCR(Real-TimePCR)对39名肾移植受者的标本进行CMV— -DNA检测。结果 :39名肾移植受者有17名检出CMV -DNA ,阳性检出率为43 6 % ;116份血浆标本中检出5例阳性 ,中位数 (Md)为5 18×102 拷贝/ml,116份尿液标本中检出13例阳性 ,Md为6 93×102 拷贝/ml,P<0 05 ,未检出同一患者血浆和尿液标本同时阳性的病例。结论 :CMV是肾移植受者中常见的感染 ;尿液与血浆中CMV -DNA检出率的差异具有统计学意义 ;Real-TimePCR是监测肾移植受者CMV感染进程和监测抗病毒药物疗效的有效工具。

生殖支原体表达水平及核苷酸序列变化与女性生殖道炎症的相关性分析

目的:了解女性生殖道中生殖支原体(Mg)的感染情况。方法:用套式聚合酶链反应技术(nPCR)对女性生殖道分泌物211例、组织231例进行Mg16SrRNA基因片段检测及核苷酸序列分析。结果:生殖道炎症组(组织24/67例,分泌物59/173例)的检出率均显著高于非炎症组(组织6/164例,分泌物2/38例)P<0.00001;在卵巢、输卵管、子宫组织中,宫颈炎(6/30)和宫颈炎性息肉(18/37)的检出率与非炎性组织比较P<0.05;在各种阴道炎(57/153)中,淋菌性(16/63)、霉菌性(24/52)、滴虫性(13/29)阴道炎检出率与正常人(1/38)比较,差异有显著性,P<0.0001;对5例Mg阳性标本的16SrRNA基因片段一级结构序列分析,发现与国际标准株Mg37同源性达97.8%,有一个T碱基插入。结论:Mg的感染与女性生殖道炎症密切相关。

肾移植受者并发巨细胞病毒感染的临床实验研究

目的 :探讨肾移植受者并发巨细胞病毒 (Cytomegalovirus ,CMV)感染后实验指标的变化及各指标的相关性 ,为诊断CMV感染及预防CMV病发作提供依据。方法 :运用Real TimePCR及流式细胞分析法等技术对肾移植受者的标本进行检测。结果 :(1)肾移植术后 14周内 ,尿液、血浆及白细胞中CMV DNA阳性检出率分别为 73 5 %、79 4 %及85 3% ;肾移植术后 18周内 ,尿液、血浆及白细胞中CMV DNA阳性检出率分别为 82 1%、85 7%及 85 7% ;(2 )肾移植术后 8周内 ,血浆及白细胞中CMV DNA的载量随术后时间的延长而增加 ;尿液中CMV DNA的载量在术后 12周内随时间的延长而波动性增加 ;(3)尿液、血浆及白细胞内CMV DNA检出率的峰值分别出现在肾移植术后第 12周、第 8周内及第 8周时 ;(4 )肾移植术后第 8周时 ,尿液中CMV DNA载量与CD3+ T淋巴细胞 (P =0 0 0 2 0 )、CD4 + T淋巴细胞 (P=0 0 0 19)、CD5 6 + T淋巴细胞 (P =0 0 2 35 )及血清肌酐 (P =0 0 2 5 3)的相关性具有统计学意义 ,而与CD8+ T淋巴细胞、丙氨酸转移酶、谷草转氨酶、血清尿素氮等的相关性无统计学意义 (P >0 0 5 ) ;血浆及白细胞中CMV DNA载量均只与丙氨酸转移酶的相关性有统计学意义 (P <0 0 0 1) ;结论 :(1)Real

急性颅脑外伤机体抗氧化能力的研究

颅脑外伤132例，正常对照235例，用比色法测定血液总抗氧化能力、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）、谷胱甘肽（GSH）、VitE的水平，结果：①外伤后24h，总抗氧化能力和SOD水平显著高于对照组（P＜0.01）；GSH-PX，GSH，VitE显著低于对照组（P＜0．0001）。②外伤后24、48、72h上述5项指标都趋于下降，其中SOD（P＜0．0005），GSH（P＜0．05）的降低有显著性差异。③伤后72h血液丙二醛浓度明显高于对照组（P＜0．05）。提示增强机体的抗氧化能力，将有助于加速脑组织损伤的康复。

结直肠癌组织中CD_(40) mRNA的表达变化及临床意义

目的观察结直肠癌组织中CD40mRNA的表达变化,并探讨其临床意义。方法应用RT-PCR法分别检测30例结直肠癌及其癌旁组织中CD40mRNA的相对表达量,并分析其表达与结直肠癌患者性别、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期相关性。结果结直肠癌组织中CD40mRNA的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05);结直肠癌组织中CD40mRNA的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期相关(P<0.05),与患者性别、浸润深度及远处转移无关(P>0.05)。结论结直肠癌组织中CD40mRNA表达显著降低,并与肿瘤的浸润性生长相关;CD40分子可能成为判断结直肠癌预后的有效指标。

常州市春季呼吸道感染病原体调查报告

用聚合酶链反应技术，对呼吸道感染55例，进行咽拭子核酸片段扩增及序列分析。结果：①本次呼吸道感染儿童36例中，查到c19细小病毒、生殖支原体、沙眼衣原体各2例，肺炎支原体6例，肺炎衣原体20例，未查到腺病毒（AD）。②成人组中查到CT1例，MPn4例，CPn10例，未查到c19－V、Mg和AD。CPn感染率显著高于对照组（P＜0.001）。提示合并衣原体及支原体感染应当引起高度重视。

载脂蛋白M在结直肠癌组织中的表达及其临床病理相关性

目的探讨载脂蛋白M（apoM）在结直肠癌组织中表达水平的变化及其临床相关性。方法采用荧光定量PCR检测20例结直肠癌组织及其癌旁组织中apoM的mRNA表达：采用免疫组织化学方法检测7例正常肠黏膜、6例肠炎组织、10例肠息肉、20例结直肠癌及其癌旁组织中apoM的蛋白表达水平。结果apoMmRNA在结直肠癌组织和癌旁组织中均有表达．前者相对表达量显著低于后者（0．05±0．01比0．19±0．05，P〈0．05）。无淋巴结转移者apoMmRNA表达水平显著低于有淋巴结转移者（P〈0．01）。结直肠癌组织中apoM蛋白表达中位分值为5．50．显著低于癌旁组织（10．5，P〈0．05）、肠炎组织（9．75，P〈0．05）、肠息肉组织（11．0，P〈0．01）及正常黏膜组织（10．5，P〈0．05）。未见结肠癌组织中apoM蛋白水平与患者临床病理特征有关（P〉0．05）。结论载脂蛋白apoM在肠癌组织中的mRNA及蛋白水平较正常组织及良性病变组织显著降低。结直肠癌组织中apoMmRNA表达水平与淋巴结转移有关。

实时荧光定量PCR检测人apoM方法的构建

目的建立检测人载脂蛋白M（apoM）的实时荧光定量PCR技术。方法采用Pri merExpress Versions2.0设计引物及Taq Man探针,检测apo M基因。将扩增的apo M基因片段纯化后与pMD19-T载体连接,克隆构建含apo M基因片段的重组质粒,作为定量检测apo M基因表达的标准品。结果PCR扩增产物经测序分析证实为apo M特异性片段。本法灵敏度为40copies/μl,线性范围为4.00×101~4.00×108copies/μl,相关系数为1.000,扩增效率E为90.5%,批间变异系数为6.38%~17.9%。结论成功建立了检测人apo M的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好,灵敏度高。

ShineRoar探针技术检测单核苷酸多态性

目的建立一种低成本、高效率、操作简便的单核苷酸多态性(SNP)检测技术。方法采用自行设计的"ShineRoar 探针",结合融解曲线技术检测目的基因 SNP。并根据其工作原理分别对肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)和载脂蛋白 M(apoM)的基因多态性进行检测;同时用 DNA 测序技术鉴定 ShineRoar 探针技术的准确性。结果融解曲线分析结果显示,某一基因的野生型及突变型纯合子分别在2个不同的融解温度出现融解谷。TNFRⅡ基因第6外显子196位突变(ATG→AGG)所产生的 T 和 G 等位基因的融解温度分别为(52.84±0.75)℃和(58.38±0.61)℃;apoM T-778C 突变所产生的 T 和 C 等位基因的融解温度分别为(42.55±0.73)℃和(49.19±0.57)℃。一致性 Kappa 检验显示 ShineRoar 探针技术与 DNA 测序技术的 SNP 检测结果一致(Kappa=1,P=0.000)。结论ShineRoar 探针技术简单、快速、准确,适用于大批量基因分型的研究。

载脂蛋白M启动子区的一个新单核苷酸多态性位点及其与冠心病易感性的关系

目的检测载脂蛋白M（apoM）基因启动子区域的单核苷酸多态性（SNP），探讨多态性位点对转录活性的影响以及与冠心病易感性的关系。方法将受试者分为2组：冠心病组，经冠状动脉造影证实1或1支以上血管直径狭窄50％以上者206例，男165例，女41例，平均年龄（61．9±9．2）岁；对照组，冠状动脉造影无病变者209例，男157例，女性52例，平均年龄（60．4±9．1）岁。设计2对引物用以扩增apoM启动子区序列，采用PCR产物直接测序法进行序列分析。比较冠心病组和正常组间各基因型及等位基因频率分布的差异。进一步利用基因重组和定点突变技术体外观察SNP对apoM基因启动子转录活性的影响。结果在apoM启动子区一724位发现1个新的胞嘧啶核苷酸缺失突变（一724delC）。冠心病组-724del等位基因频率高于对照组（8．0％比4．1％，OR：2．054，95％CI1．125～3．749，P：0．017），-724del等位基因携带者血浆apoM的表达水平降低．总胆固醇水平明显高于C／C基因型[（6．04±0．90）mmol／L比（4．95-4-1．00）mmol／L，P〈0．01]。与apoM野生型启动子比较，一724C位点发生缺失突变后，apoM启动子活性明显下降（相对荧光素酶活性比值：1．13±0．25比2．11±0．15，P：0．009）。结论新发现的-724delC缺失突变可降低apoM启动子活性，下调apoM蛋白表达水平，增加冠心病的发病风险。

实时荧光定量PCR检测人组织因子及其剪切体方法的构建

目的建立检测人组织因子（flTF）及其剪切体（asTF）的实时荧光定量PCR检测技术。方法分别采用文献报导及自行设计的检测人flTF和asTF的引物及TaqMan探针,经优化反应体系及反应条件后,用于检测人flTF和asTF基因。将扩增的人flTF和asTF的基因片段纯化后分别与pMD19-T载体连接,分别克隆构建含flTF和asTF基因片段的重组质粒,作为实时荧光定量PCR检测flTF和asTF基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物分别经测序证实为flTF和asTF的特异性片段。本法检测flTF和asTF基因表达的灵敏度均为40拷贝/μl,线性范围均为4.00×101~4.00×107拷贝/μl,相关系数均为1.000;扩增效率分别为flTF 91.15%,asTF 90.53%,批间变异系数分别为flTF 3.04%~9.31%,asTF 3.01%~9.64%。结论成功建立了检测人flTF和asTF的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好,灵敏度高。

颅脑损伤后血清垂体前叶激素的变化

目的探讨颅脑损伤对内分泌功能的影响。方法应用磁性酶联免疫定量分析法,对颅脑损伤后血清催乳素(PRL)、促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)做定量分析。结果(1)与正常人(88例)相比,颅脑损伤后(134例)血清PRL和FSH显著增高,P<0.0001。LH和TSH未见显著变化。(2)伤后24、48、72小时动态观察(32例),发现伤后24小时内PRL、FSH和LH有显著增高,48和72小时显著下降,P<0.01～0.001。TSH未见显著性变化。结论颅脑损伤后对垂体前叶激素分泌有影响,主要是PRL显著增高。

颅脑外伤后抗氧化能力的变化及意义

目的探讨急性颅脑外伤后抗氧化能力的变化及意义。方法采用比色法检测235例正常人和156例脑外伤患者血液超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)、维生素E(VitE)和总抗氧化能力(TOP)的变化。结果伤后TOP和SOD显著增高GSH-PX,GSH,VitE显著降低;伤后24、48、72小时动态观测表明SOD和GSH显著降低。结论颅脑外伤后抗氧化能力下降,自由基氧化产物增多。