甘蔗内生菌分离鉴定及功能多样性研究

为探究甘蔗内生菌多样性组成及相关特性,本研究采用稀释涂板法分离并结合形态观察和分子标记(gyrB,rpoB, ITS, 16S rDNA)进行鉴定。结果表明,从12个栽培品种(系)和5个野生种无性系的根、茎、叶组织中共分离到细菌589株、放线菌34株和真菌46株;细菌中固氮菌有41株,溶磷菌有98株,解钾菌有52株,对黄曲霉和禾谷镰刀菌具有拮抗作用分别有44株和35株。内生细菌分属21个属,其中芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属和泛菌属为优势属;内生真菌分属于枝顶孢属、链格孢属、曲霉属、镰刀菌属、枝孢属等17个属,而放线菌仅为链霉菌属。具有潜在植物益生功能的菌株主要集中在芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、类芽孢杆菌属及泛菌属。本研究显示甘蔗栽培品种(系)和野生种无性系均含有丰富的内生菌资源,且栽培品种(系)所含内生菌在数量和多样性上均高于野生种无性系;12个栽培品种(系)间所分离到的内生细菌大部分相同,但也存在差异。通过初步的功能鉴定,筛选出一些具有应用潜力的益生微生物,为开发相应功能的生物菌剂奠定基础。

甘蔗内生菌B9的鉴定及其促生长机制和定殖能力的研究

B9是一株分离于甘蔗品种“云蔗99-91”根部的内生菌,笔者对其种属鉴定与促生长机制开展研究,以期应用于甘蔗生产。试验通过传统方法与16S rRNA等看家基因片段测序对菌株进行分类鉴定;采用固体透明圈、酸性钼蓝比色法、火焰分光光度法、GFP荧光标记等方法测定与研究B9菌株固氮、溶磷、解钾、产IAA、嗜铁素等生物学活性及在甘蔗苗内的定殖情况;最后通过回接法研究菌液处理对玉米种子萌发与甘蔗幼苗生长发育的影响。结果表明B9菌属于芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),具有固氮、溶磷、解钾、产生IAA和嗜铁素的能力。用B9菌液处理后能提高玉米种子的发芽势与促进根芽组织生长,同时处理组甘蔗苗株在农艺性状与生理生化水平上明显优于无菌清水对照,并且发现B9菌能在甘蔗根茎叶内稳定定殖。本文鉴定了B9菌的种类和功能,阐明了B9菌的促生长机制和定殖能力,为开发生物菌肥并应用于生产提供理论依据。

内生枯草芽孢杆菌B9促生长效果及产吲哚乙酸(IAA)能力研究

【目的】内生枯草芽孢杆菌B9菌株是一株分离于甘蔗根部的内生枯草芽孢杆菌,探究其促生长作用及产吲哚乙酸(IAA)能力,为下一步将其研制成高效微生物肥料接种剂提供理论依据。【方法】以玉米种子、甘蔗单芽茎和甘蔗组培苗为供试材料,通过浸泡接种玉米种子与甘蔗单芽茎,明确B9的最适促生长密度,观察它们的生长势并测定芽长、根长、株高、生根数和根系重量;通过灌根接种甘蔗组培苗,观察试管组培苗中根系长势,测定盆栽组培苗根长、株高、根系活力、氮代谢相关酶活性、叶绿素以及光合指标,运用液质联用仪检测无菌上清液中与促生长相关的IAA的含量。【结果】B9菌液稀释后对玉米种子和幼苗均有一定的促生长作用,随着菌液稀释倍数的增加,促生长效果呈先增加后减弱的趋势,在1.0×10^6 CFU/mL时,对玉米生长情况的影响达到最佳。甘蔗单芽茎经1.0×10^6 CFU/mL的B9菌液处理后,其相关的形态和农艺性状均显著优于清水对照(P<0.05)。在该密度下,甘蔗组培苗的株高、根长、叶绿素含量、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和根系活力等指标均明显优于CK。在LB培养基B9菌液中,吲哚乙酸含量增加明显,在9 d时达到(95.63±2.33)ng/mL,比空白对照增加1054.9%。在Landy培养基菌液中,同样检测到吲哚乙酸呈不断增长的态势,在9 d时比对照高出2.56倍。【结论】B9菌株对甘蔗和玉米均具有明显的促生长效果,且发酵液中的IAA分泌能力强。

不同肥料处理对甘蔗产量性状、糖分及效益的影响

为解决化肥用量过多问题,提高甘蔗节本增效,选取云南省6个主要蔗区作为试验点,以B9菌剂、有机肥、复混肥不同组合为供试肥料设置不同施肥处理,探讨各肥料处理对甘蔗生长、产量、糖分等农艺性状的影响,并分析甘蔗种植效益。结果表明,施用B9菌剂组合的肥料不同程度促进甘蔗出苗;6个试验点中除盈江县和景谷县施用B9菌剂组合的肥料对促进甘蔗分蘖作用不明显外,其他4个试验点均达到有效促进;与普通复混肥处理相比,施用B9菌剂的处理在株高、茎径、有效茎数、蔗茎产量、蔗糖分等性状有一定程度的增加,但影响不显著。选取元江县进行经济效益分析,结果表明,施用B9菌剂组合的肥料比对照收益高,而没有B9菌剂组合的肥料比对照低。综上所述,施用"B9菌剂+有机肥+化肥"组合的肥料在稳产减肥(化肥)方面起到了积极的作用,值得应用推广。

接种甘蔗内生菌B9对不同甘蔗品种生长的影响

为探究甘蔗促生长菌株B9对不同基因型甘蔗品种的促生长效果,本研究采用6个不同基因型的甘蔗栽培种作为研究对象,以接种菌株与否分为处理组及对照组(CK),分别测定各甘蔗幼苗的株高、根长、鲜重、干重、株高、茎径、茎长等农艺性状以及叶绿素含量、根系活力、可溶性糖、可溶性蛋白等生理指标。通过综合生理指标及各方面农艺性状分析B9菌株对不同基因型甘蔗的促生长情况。由试验结果可知,在接种B9菌株后,不同甘蔗品种在株高、茎径、叶长、叶片数、地下部分和地上部分的鲜重、干重等农艺性状均显著优于CK;同时处理组中各甘蔗品种叶绿素含量、植株光合指标、蛋白质含量、可溶性糖含量、谷氨酰胺合成酶(GS)及谷氨酸合成酶(GOGAT)活性、根系活力等生理指标较CK均明显提升,其中‘桂糖11’在叶绿素含量、气孔导度(Gs)、可溶性糖含量、谷氨酰胺合成酶活性等方面促进效果较为显著;对‘粤糖93-159’的谷氨酸合成酶活性促进效果最为显著;‘柳城09-182’的可溶性蛋白含量、根系活力等方面相比其余品种增幅最大;‘滇糖01-58’中净光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)促进效果最佳。可见,内生菌B9对不同基因型的甘蔗品种均存在一定促生长作用,但促生长效果因基因型不同而存在差异,研究证明了促生菌株B9的普适性,为甘蔗的选种问题提供了参考依据。

甘蔗与蔗茅杂交亲本及后代材料的抗旱性鉴定

研究旨在筛选出优良抗旱育种材料,为今后甘蔗抗旱育种和抗旱栽培技术提供重要的理论依据。采用盆栽干旱处理,测定蔗茅野生种无性系、甘蔗栽培品种(系)及其杂交后代共12份材料苗期与抗旱相关的8项生理生化指标,利用极点排序法对供试材料的抗旱性进行了综合评价。结果表明:干旱胁迫下,12份供试材料的Pro、MDA、SS及PMP均呈上升趋势,SP、Chl和SOD活性呈下降趋势,CAT活性有升有降。极点排序法分析表明,12个供试材料的抗旱强弱为:’蔗茅99-2’>’蔗茅99-1’>’蔗茅99-4’>’蔗茅I91-8’>’蔗茅99-3’>’蔗茅90-29’>’滇蔗01-58’>’滇蔗04-14’>’滇蔗02-39’>’蔗茅II91-2’>’新台糖10’>’崖城89-9’,说明蔗茅优质抗旱性状可以通过基因渗透方式传递给后代。在苗期干旱胁迫下’,蔗茅99-2’在渗透调节等方面表现出积极的生理响应。

3株甘蔗内生芽孢杆菌的抑菌促生活性评估

【目的】测试3株甘蔗内生细菌的抗病促生长活性,并确定优良菌株的分类学地位,为后续甘蔗生防菌剂的研究与开发提供理论依据与材料。【方法】以分离自甘蔗栽培种闽糖69-421和滇蔗01-58的3株芽孢杆菌P8、Q2和P7为研究对象,测定其广谱抑菌活性和促生长活性指标;检测菌株的常规生理生化指标,对菌株16S rRNA和GyrA两个看家基因进行测序,采用MEGA软件邻接法对3株菌株进行聚类分析。【结果】3株菌株对串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、烟草炭疽菌(Colletotrichum micotianae Averna)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、大斑凸脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍离蠕孢菌(Bipolaris maydis)均具有良好的抑制效果。菌株Q2对玉米小斑病菌的抑制效果最好,抑制率达到81.60%,对其余病原菌抑制率也达到61%以上;其嗜铁素合成能力强于P8和P7;其无机磷利用能力强于P8和P7,可溶性磷含量达166.95 mg/L;培养3 d时,Q2的纤维素酶活性为5.22 U/mL,活性较高,产生纤维素的能力较强。经鉴定,菌株Q2为枯草芽孢杆菌。【结论】甘蔗内生菌枯草芽孢杆菌Q2具有良好的广谱抑菌活性,其嗜铁素、溶磷和纤维素酶活性高,具有进一步开发为抗病促生长生物菌剂的潜力。

蔗茅WRKY转录因子家族基因鉴定及低温表达模式分析

WRKY转录因子是仅存于高等植物中的一个超级基因家族,在植物的多种应激反应中起着重要作用。为分析蔗茅WRKY基因家族,本研究利用生物信息学方法对蔗茅EfWRKY基因家族进行分析,并在冷胁迫下对EfWRKY基因的表达进行了分析。结果显示,EfWRKY基因的氨基酸数在58~633,分子量在6.47133~67.80718 k D,等电点在5.28~10.04,不稳定指数在25.19~84.29,脂肪系数在32.83~76.69,平均亲水系数在-1.337~-0.111。亚细胞定位显示41个蔗茅WRKY蛋白均在细胞核内。EfWRKY基因家族的二级结构中无规则卷曲占比最高。氨基酸序列比对及与水稻构建进化树分析表明,EfWRKY基因家族含有41个家族成员,共分为Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅲa和Ⅲb 6个组。经Heatmap分析发现41个基因在受到不同程度的冷胁迫下EfWRKY基因都有不同程度的表达。

一株甘蔗内生菌鉴定及其溶磷能力的研究

采用形态观察、生理生化测定以及16S rDNA、gyrB和rpoB基因片段比对,对分离自甘蔗品种粤糖86-368茎部内的一株D5内生菌进行分类鉴定。在此基础上,使用平板溶磷圈法和液体培养法研究其溶磷能力,并通过盆栽试验探究其对玉米幼苗生长的影响。结果表明:D5菌株属于Pseudomonas extremorientalis;D5菌株对不同磷酸盐的溶磷能力表现不同,表现为磷酸三钙>植酸钙>磷酸铁,溶磷量分别为0.939±0.012、0.655±0.016、0.125±0.005mg/mL,同时,在溶磷过程中,液体培养基的pH均有不同程度的降低,活菌数除了在磷酸铁培养基中一直下降外,其他磷源培养基中均是先升后降的趋势。施用菌剂后,处理组(D5+P)比对照组(CK+P)玉米幼苗的总鲜重、总干重、苗株总磷含量分别增加45.92%、32.65%、45.01%。因此,D5菌株具有制备微生物菌肥的潜力。

甘蔗及甘蔗近缘属内生菌的筛选、鉴定与功能研究

为进一步挖掘甘蔗栽培种及其亲缘野生种中内生菌的功能与价值,筛选出具有促进植物生长功能活性的微生物菌株,用于促进甘蔗产业的增收增产。以前期分离纯化获得的589株甘蔗内生细菌为基础,筛选并鉴定具有固氮、溶磷、解钾等促生长特性的功能菌株。在此基础上,对菌株产生的有机酸、吲哚乙酸(IAA)和嗜铁素也进行了定量测定与种类划分。结果表明:共有12株功能菌株被筛选得到,分别编号为B7、B9、C9、D5、E12、F5、G3、H5、J8、L9、M3、O9,其中多株菌株同时具有固氮溶磷解钾等生物学活性;12株菌株分别属于Pantoea、Pseudomonas、Enterobacter、Serratia、Acinetobacter和Bacillus 6个属。进一步功能研究结果表明:菌株G3与C9对于无机磷和有机磷的溶解能力较强,溶磷量分别为1386.97±331.96与2523±68.17mg/L;菌株M3解钾能力较强,解钾量为8.59±0.08mg/L;各菌株所产生的有机酸主要为酒石酸,其次为苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸;12株功能菌株可产生IAA及嗜铁素,但产生嗜铁素的种类随菌株而异;各菌株与甘蔗种苗共培养过程中均能促进甘蔗种苗芽长与根长的生长,其中表现较优的有E12、C9、G3菌株处理组。该研究可为后续微生物菌肥开发奠定材料基础,也为相关研究提供参考。

甘蔗赤腐病内生拮抗菌YC89的筛选及鉴定

【目的】筛选防治甘蔗赤腐病(sugarcane red rot)的生防菌株。【方法】实验以前期分离获得的甘蔗内生细菌为目标菌,以甘蔗赤腐病的病原真菌镰孢炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went.)为指示菌,采用平板对峙法筛选对该病菌有较强抑制作用的菌株,然后通过琼脂扩散法测定菌株代谢产物对抑菌活性的影响,并对具有较好拮抗效果的高效菌株进行抑菌广谱性分析并对其进行鉴定。最后通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA和gyrA序列分析对高效菌株YC89进行鉴定。【结果】经初筛筛选到抑菌带均大于1.60 cm的5株拮抗细菌,其中X22、W2、YC89抑菌带均高达1.87 cm。对初筛得到的5株内生菌进行复筛,结果所示菌株YC89、H1、X22、W2、YT93对镰孢炭疽菌的抑菌率都在75%以上,其中菌株YC89对该病菌的抑菌效果最好,其抑菌率为78%。菌株YC89的发酵液、上清液、过滤液及粗蛋白提取液对镰孢炭疽菌的生长有较强的抑制作用,且菌株YC89对玉米大斑病、甘蔗梢腐病、草莓灰霉病等7种病原菌也有较好的抑制效果。通过菌株鉴定结果,初步将YC89菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。【结论】菌株YC89对镰孢炭疽菌具有较好的抑制效果,表明其对甘蔗赤腐病的生物防治具有较大的应用潜力。

甘蔗赤腐病病原菌的分离与ITS序列鉴定

从甘蔗赤腐病病原菌分离纯化得到5株病原真菌(CF-1、CF-2、CF-3、CF-4、CF-5),对其进行致病性测定、形态学观察和ITS序列分析。结果表明,CF-1和CF-4均能引起与田间病害一致的症状,通过ITS1和ITS4对致病菌的基因片段进行扩增,结果显示,菌株CF-1与KU933924.1相似性达到99.00%,CF-4与MH854879.1相似性达到99.42%。综合病害症状观察、形态观察和ITS序列分析结果,将甘蔗赤腐病病原菌CF-1鉴定为镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went.),将CF-4鉴定为球黑孢菌[Nigrospora sphaerica (Sacc.)E.W. Mason.]。

云南草果SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选

草果为药食两用的草本植物,近年来在市场上供不应求,但关于草果居群的分子鉴定及种质资源的研究极为稀少。为使云南草果产业更加健康和可持续的发展,本实验对云南草果进行了SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选,为研究草果遗传多样性提供了依据。实验采用L16(43)正交试验设计,对PCR反应体系中的3个因素(2×Taq PCR Starmix,引物, DNA模板)进行优化,并利用单因素分析法,对PCR退火温度、PCR扩增产物点样量进行实验与分析。最终确定5个因素的最佳水平,即DNA模板(50 ng/μL) 2μL,2×Taq PCR StartMix 6μL,正反引物(10μmol/L)各1.5μL,dd H2O补足至20μL (即加入ddH2O 9μL),PCR产物点样量可以选择在1.5～2μL之间。从48对SSR引物中筛选出了7对扩增结果好的引物。7个SSR引物可用于草果资源的遗传多样性研究,为分子技术研究提供了科学依据。

蔗茅EfNAC基因的克隆和生物信息学分析

为了更好地利用甘蔗野生种蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)的抗逆相关基因,并为转基因甘蔗抗逆育种提供可靠的候选基因。本研究利用电子克隆和RT-PCR的方法在蔗茅野生种‘蔗茅99-2’中克隆到一个干旱诱导表达基因,并命名为FfNAC(GenBank登录号:MT499790)。生物信息学分析表明,FfNAC基因ORF长度为765 bp,共编码254个氨基酸,具有一个保守的NAM结构域。编码的蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,没有跨膜结构。本研究为深入研究蔗茅干旱胁迫的分子调控机制和转基因甘蔗抗旱育种提供理论依据和技术支撑。