人重组钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的高效表达、纯化及细胞凋亡检测

目的 :为细胞凋亡研究提供快速可靠的实验方法。方法 :利用RT PCR技术从人外周血单核细胞系U937cDNA文库中扩增出编码钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ (AnnexinⅤ )cDNA ,并克隆到大肠杆菌表达载体中 ,在大肠杆菌中表达含凝血酶识别序列的MS2AnnexinⅤ融合蛋白。表达产物经凝血酶消化 ,可除去MS2细菌蛋白 ,再经离子交换层析纯化 ,可得成熟的AnnexinⅤ纯品 ,FITC标记后的AnnexinⅤ可用于细胞凋亡的检测。结果 :在大肠杆菌表达的人重组AnnexinⅤ占菌体蛋白的 5 6 % ,经纯化获得 99%纯度的非融合型AnnexinⅤ ,FITC标记的An nexinⅤ能有效地检测凋亡细胞。结论 :成功地建立了批量获取AnnexinⅤ的技术路线 。

人心肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的高效表达及纯化

目的 :获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白 ,为临床上检测心肌损伤及预后提供新的诊断方法。方法 :利用RT PCR方法从人心肌细胞的cDNA文库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA ,并克隆到大肠杆菌表达载体中 ,表达含凝血酶识别序列的MS2 cTnI融合蛋白 ,纯化后用Western blot进行鉴定。结果 :从人心肌cDNA文库中扩增出编码人cTnI的cDNA ,克隆并在大肠杆菌中表达 ,表达量达 30 %以上。经离子交换柱纯化 ,最终产物纯度在95 %以上。可与其特异性单克隆抗体反应。结论 :cTnI能够在大肠杆菌中高效表达和纯化 。

人IL-1受体拮抗剂研究进展

白细胞介素-1(IL-1)受体拮抗剂是由单核巨噬细胞等分泌的小?分子蛋白质,通过特异地与白细胞介素-1受体结合阻断IL-1的生物活性,在治疗败血性休克、AML、CML、移植物抗宿主反应、炎症、发热等疾病中有显著疗效,是一种很有发展前景的新型生物应答调节剂.

趋化素样因子(CKLF1)对骨髓细胞增殖活性的研究

目的 研究趋化素样因子 1(CKLF1)对造血功能的调节作用。方法 利用 MTT法，检测 CKLF1真核细胞表达载体转染上清在液体培养基中，对人低密度骨髓细胞和小鼠骨髓细胞的增殖调控作用；并在半固体培养基中，观察其对人低密度骨髓细胞集落形成的刺激作用。结果 COS-7细胞表达的 CKLF1能明显促进人和小鼠骨髓细胞的增殖，并能促进人骨髓细胞的集落形成，与 GM-CSF有协同刺激作用。结论 CKLF1能促进人和小鼠骨髓造血干

抗人凋亡相关蛋白TFAR19的单克隆抗体制备及鉴定

目的研制鼠抗人凋亡相关蛋白 TFAR19的单克隆抗体，以进一步探讨 TFAR19蛋白的结构与功能。方法以纯化的重组人 TFAR19蛋白为抗原 ,免疫 BALB/c小鼠，将 TFAR19蛋白免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0进行细胞融合，经克隆筛选获得鼠抗人 TFAR19蛋白单抗的杂交瘤细胞株，以间接 ELISA、 Western免疫印迹分析等方法进行单克隆抗体的鉴定。结果获得了 3株稳定分泌抗人 TFAR19单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (C1,C10,2C12),其分泌的单抗效价高，特异性好，亲和力不一，免疫球蛋白亚类均为 IgG1。 Western免疫印迹分析证明 TFAR19蛋白在凋亡细胞中高表达。结论所获单抗能特异识别原核及真核细胞表达的 TFAR19蛋白，为进一步探讨 TFAR19蛋白的生物学效应提供了条件。

凋亡相关蛋白TFAR19在TF-1细胞凋亡中出现细胞核转位

目的 :探讨凋亡相关分子TFAR19在TF 1细胞凋亡过程中的表达及定位。方法 :以TFAR19的单克隆抗体为工具 ,采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞仪等研究手段 ,观察细胞凋亡过程中TFAR19分子的表达水平和细胞内定位 ,分析其与细胞膜磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine,PS)以及细胞核DNA片段化的关系。结果 :TFAR19蛋白在撤除GM CSF的TF 1细胞中表达水平显著增高 ,伴有明显的核转位现象 ,且早于PS外翻和细胞DNA片段化。结论 :TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一 ,这一新发现为进一步探讨TFAR19蛋白的生物学效应 。

果蝇程序化死亡基因5(PDCD5)同源cDNA的克隆和序列分析

为了解人类白血病细胞凋亡相关新基因 TFAR1 9(PDCD5,programmed cell death5)在不同种属间的序列同源性 ,利用 EST(expression sequence tag)拼接、RT- PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术 ,首次成功地进行了果蝇 PDCD5同源 c DNA编码区基因克隆和序列分析 .发现果蝇与小鼠及果蝇与人 PDCD5在核苷酸水平上分别有 57.5%和 57.1 %的同源性 ,在氨基酸水平上分别有 46.8%和 46.4%的同源性 .功能区分析发现 ,果蝇 PDCD5c DNA编码 1 33个氨基酸 ,计算机预测可能是一种核蛋白 ,含 5个可能的酪蛋白激酶 (casein kinase )磷酸化位点 ,2个可能的 PKC磷酸化位点 ,与人 PDCD5的功能区类似 .因而果蝇 PDCD5是与人 PDCD5同源的新基因 ,可能都与细胞程序化死亡相关 .

人硫氧还蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对内毒素血症小鼠的保护作用

为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现 ,TRX蛋白可明显促进去细胞因子诱导的NFS 6 0细胞增殖和撤血清后MCF 7细胞的增殖 ,并发现外源性TRX可明显对小鼠内毒素血症起保护作用 .

凝血酶对人重组内皮细胞衍生IL—8融合蛋白转换作用

本文报道利用基因工程技术在大肠杆菌中表达出入内皮细胞衍生IL-8(EDhIL-8)与细菌蛋白lacZ 的融合蛋白lac-hIL-8和lac-T-hIL-8,后者含有一个人工合成凝血酶切点。EDhIL-8上含有一个凝血酶切点,凝血酶可以将lac-hIL-8及以前表达的MS2-hIL-8水解为有生物活性的天然IL-8,而对含有两个凝血酶切点的lac-T-hIL-8无水解作用。这些结果提示凝血酶的功能不仅依赖于所识别的氨基酸,而且依赖于这些氨基酸形成的构象。

提高人重组IL-6在真核细胞中表达的新途径

为提高IL-6在真核系统中的表达效率,我们在构建真核表达载体pcDNA3IL-6的基础上,用表达载体pCI中的CMV启动子和下游所带的β-球蛋白的第一个内含子,置换了pcDNA3中的CMV启动子,构建了一种新的表达载体,使IL-6的表达水平提高了7.5倍。此外,我们还研究了pAdVAntage共转染对IL-6表达的影响,使之表达水平提高了3.6倍。以上结果为细胞因子在真核系统中的高效表达提供了有益的经验。

人重组IL-8在大肠杆菌中表达及其活性检测

本文报道了利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组白细胞介素8(rh(?)。将质粒pGEM-hIL-8中的IL-8cDNA片段亚克隆到表达载体pMS31b中,在大肠杆菌中成功地高效表达出人IL-8融合蛋白,表达产物具有体内、体外对小鼠中性粒细胞的趋化活性。表明N端连入一段细菌蛋白并不影响IL-8的趋化活性。

白细胞介素-1受体拮抗剂对遗传性视网膜变性视细胞凋亡的影响

背景遗传性视网膜变性是主要致盲性眼病之一，包括一系列以慢性进行性视网膜变性为病理特征的异常；白细胞介素-1（IL-1）参与变性与凋亡过程的调节，而白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）对细胞凋亡的影响了解较少，IL-1ra是否能阻止视网膜变性值得研究。目的研究IL-1ra对自发性遗传性视网膜变性大鼠视细胞凋亡的影响。方法选择SPF级出生后9、15、16、25、30、35、40、50、60d的RCS大鼠各9只9只眼制备视网膜切片，采用TUNEL凋亡检测试剂盒检测不同年龄大鼠视网膜凋亡细胞。选择出生后15d的RCS大鼠9只，右眼玻璃体腔注射质量浓度1．8g／LIL-1ra 1μl，左眼玻璃体腔注入PBS 1μl作为对照，分别待大鼠20日龄、25日龄时各重复注射药物1次，30日龄时处死实验大鼠并制备视网膜切片，采用TUNEL凋亡检测试剂盒检测及分析视网膜细胞凋亡情况。采用单因素方差分析比较不同鼠龄视网膜中阳性细胞核面积百分率的差异，采用配对t检验比较大鼠IL-1ra注射组与PBS注射组视网膜各层厚度的差异。结果RCS大鼠视网膜视细胞自出生后第25天出现凋亡，第30～35天达高峰，不同鼠龄间大鼠视网膜TUNEL阳性视细胞核面积百分率的差异有统计学意义（F=28．020，P〈0．01）。TUNEL凋亡图像分析结果显示，30日龄大鼠IL—lra注射眼视网膜TUNEL阳性染色弱于PBS注射眼，且阳性染色细胞数少于PBS注射眼；IL-1ra注射眼大鼠视网膜TUNEL阳性视细胞核总面积及相对面积均明显低于PBS注射眼，差异均有统计学意义[总面积：（223．052±153．092）μm2 VS．（1235．050±359．767）μm2，t=4．370，P〈0．01；相对面积：（2．206±1．531）％VS．（7．269±1．624）％，t=3．250，P〈O．01]。IL-1ra注射组和PBS注射组视锥与视杆细胞层厚度分别为（15．324±9．035）μm和（49．566±4．605）μm，差异有统计学意义（t=22．674，P〈0．01），但2个组间外核层（即由视锥细胞与视杆细胞的细胞体和细胞核组成）厚度比较差异无统计学意义（t=0．268，P〉0．05）。结论遗传性视网膜变性眼中IL-1对视网膜凋亡发挥一定的调控作用，IL-1ra对遗传性视网膜变性早期具有潜在的临床治疗价值。

大肠杆菌表达的人重组IL-3的纯化

本文继大肠杆菌表达含凝血酶切点的人重组IL-3融合蛋白成功的基础上进一步探讨了天然型rhIL-3的纯化。超声破碎细菌细胞得包涵体,经洗涤处理可使包涵体纯度达90％,用8mol/L尿素变性溶解包涵体沉淀后直接稀释复性,再超滤浓缩、凝血酶消化,释放天然型rhIL-3。经DEAE Sepharose Fast Flow和Sepharcyl-100 HR层析得到天然型IL-3,纯度达96％,回收率20％以上,具有刺激正常人骨髓细胞形成集落的活性。本实验为大批量重组IL-3的生产创造了条件。

重组人截短型胰岛素样生长因子1在大肠杆菌中的高效表达

目的:建立人截短型胰岛素样生长因子1的原核高效表达系统。方法:利用基因重组技术将人截短型胰岛素样生长因子1〔Des(13)IGF1〕的cDNA片段克隆到融合蛋白表达载体pMTY4中,用离子交换层析法纯化蛋白并经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射免疫检测、N末端前16位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定。结果:获得含人Des(13)IGF1基因的重组质粒,在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2Des(13)IGF1融合蛋白,该蛋白经凝血酶消化后纯化可获得与天然型一致的人Des(13)IGF1。结论:该方法是获得人重组Des(13)IGF1的有效途径,对进一步研究Des(13)IGF1有重要意义。

人白细胞介素－9cDNA的PCR扩增及其在大肠杆菌的表达

利用ＰＣＲ技术从人外周血Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出人ＩＬ－９的ｃＤＮＡ，将其连入大肠杆菌表达载体后，可在大肠杆菌高效表达出人重组ＩＬ－９融合蛋白，表达量占菌体蛋白的２５％左右，有明显的刺激正常人骨髓细胞集落形成的活性。

心肌肌钙蛋白Ⅰ与心脏疾病

心肌肌钙蛋白Ⅰ是心肌特有的一种收缩调节蛋白。当缺血性心脏病发病时，血浆肌钙蛋白Ⅰ的水平明显升高，因其具有高度的心肌特异性，因此，它可作为心肌损伤的一种特异性指标，对心脏病的诊断、治疗和预后有十分重要的意义。

乙型肝炎病毒 preS 抗原在大肠杆菌中的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ和基因重组技术构建了乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）完整ｐｒｅＳ抗原高效表达克隆（ｐＭＩＰ），该克隆在大肠杆菌中表达一分子量约３１ｋＤ的融合蛋白（ＭＳ２－ｐｒｅＳ），由ＭＳ２、白细胞介素３（ＩＬ－３）Ｎ端１４个氨基酸（ａａ）接头和ｐｒｅＳ抗原组成，在ＩＬ－３Ｎ端与ＭＳ２连接处有凝血酶识别位点，可被该酶切开。ＭＳ２－ｐｒｅＳ和带ＩＬ－３Ｎ端１４个ａａ的ｐｒｅＳ均具有ｐｒｅＳ１和ｐｒｅＳ２抗原表位以及多聚人血清白蛋白（ＰＨＳＡ）受体活性，均能诱导动物产生抗ｐｒｅＳ抗体。

小鼠造血干细胞因子的cDNA克隆化及在大肠杆菌表达

造血干细胞因子（ＳＣＦ）是一种多功能造血生长因子，与其它造血生长因子协同作用，刺激不同分化阶段的造血细胞增殖和分化。本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从新生ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠胸腺组织克隆了ＳＣＦ膜外功能区ｃＤＮＡ，进而在大肠杆菌表达出具有生物学活性的重组蛋白。

抑制性底物杂交(SSH)技术研究BXSB小鼠的差异表达基因

目的：利用抑制性底物杂交技术（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ），以ＢＸＳＢ 狼疮小鼠为模型，研究系统性红斑狼疮（ＳＬＥ） 发病相关基因。方法：分离ＢＸＳＢ和Ｃ５７ＢＬ６ 小鼠骨髓细胞，提取ｍＲＮＡ，反转录构建ｃＤＮＡ 文库，利用ＳＳＨ 技术研究ＢＸＳＢ小鼠差异表达基因。结果：获得了１２ 个阳性克隆，其中有３ 个克隆编码ＴＣＲ、ＭＨＣ Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物，均在ＢＸＳＢ狼疮小鼠高表达，表明其与系统性红斑狼疮发病有关；１ 个在ＢＸＳＢ狼疮小鼠高表达的基因可能为新的ｃＤＮＡ片段，已被ＧｅｎＢａｎｋ 收录，登记号码为ＡＦ０９３４５３。结论：ＴＣＲ、ＭＨＣ Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物与系统性红斑狼疮发病有关。