滋肾通络方功效单元对CIA小鼠CD4^+T细胞miRNAs表达的差异调控作用

目的:分析滋肾通络方(ZTF)不同功效单元调控CIA小鼠CD4^+细胞中miRNAs表达的差异。方法:建立小鼠胶原性关节炎(CIA)模型,随机分为模型组、阳性药组、滋肾养阴组、祛风除湿组、化痰祛瘀组和全方组,另取4只小鼠作正常对照组。连续给药4周,末次给药1 h后,分选脾脏CD4^+T细胞,检测miRNAs表达。结果:CIA小鼠CD4^+T细胞中出现部分miRNAs表达的上调或下调。滋肾养阴单元主要上调Let-7g-5p,下调miR-27b-3p、miR-155-5p;祛风除湿单元主要上调miR-26b-5p和miR-143-3p;化痰祛瘀单元主要上调miR-26b-5p,下调miR-27b-3p;全方组的调控作用最明显。结论:ZTF各功效单元可以靶向CD4^+T细胞中不同miRNAs,产生协同/增强/叠加效应,从而在类风湿关节炎中发挥整体调节作用。

梓醇调控miR-143-3p干预Th17糖酵解和细胞分化的机制

目的探讨生地活性成分CAT通过调控miR-143-3p干预Th17糖酵解和细胞分化的机制。方法选取(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血CD4^(+)T细胞,检测miR-143-3p及糖酵解酶Glut1、HK2、PKM2、LDHA mRNA表达;体外诱导Th17分化,结合慢病毒转染诱导miR-143-3p低/高表达,未转染的细胞分为Control组、CAT组(20、40、80 mg·L^(-1)),转染细胞分为Control组、miR-143-3p上/下调组、miR-143-3p下调+CAT组,流式、qPCR、ELISA等检测Th17分化比例、miR-143-3p及糖酵解酶表达、上清液中IL-17A、丙酮酸、乳酸水平。结果RA CD4^(+)T细胞中miR-143-3p表达与DAS28、RORγt、Glut1/HK2/LDHA均呈负相关;miR-143-3p下调时Th17分化、Glut1/HK2/LDHA表达及丙酮酸分泌明显升高,miR-143-3p上调时则相反;CAT可明显上调miR-143-3p,降低HK2/LDHA mRNA及丙酮酸、乳酸水平,抑制Th17分化;CAT干预后可恢复miR-143-3p抑制状态下的HK2/LDHA mRNA水平异常上调、丙酮酸/乳酸分泌增多及Th17异常分化。结论miR-143-3p可负调控Th17糖酵解及细胞分化,CAT可通过调控miR-143-3p明显改善Th17细胞的异常分化和糖酵解异常上调。

三七总皂苷对调节性T细胞再分化为辅助性T细胞的影响

目的考察三七总皂苷(PNS)调控调节性T细胞(Treg)再分化为辅助性T细胞17(Th17)的作用。方法分离C57/BL6小鼠脾细胞,并磁珠分选出CD4^(+)T细胞,进行体外培养,采用CCK-8法筛选PNS合适的给药浓度。建立Treg再分化为Th17的细胞模型,采用流式细胞术检测PNS对Treg再分化体系中Th17细胞分化比例的影响,酶联免疫吸附法检测体系上清中Th17特征性细胞因子白细胞介素(IL)-17A的水平,实时荧光定量聚合酶链式反应检测Th17特征性转录因子RORγt mRNA及炎症因子IL-17 mRNA的表达。结果PNS可显著降低Treg再分化体系中CD4^(+)IL-17^(+)Th17细胞的比例和IL-17A的分泌水平,抑制ROR-γt mRNA和IL-17 mRNA的表达。结论一定浓度的PNS可抑制Treg再分化为Th17,调控Treg/Th17平衡,进而防治类风湿关节炎等炎症免疫性疾病的发生和发展。

三七总皂苷对巨噬细胞M1极化的影响及机制初探

目的 观察三七总皂苷(PNS)对巨噬细胞(Mφ)M1极化及炎症因子TNF-α的影响,并初步探究其效应与调节GAS6/MERTK通路表达的相关性。方法 分别建立THP-1来源Mφ单培养体系和THP-1来源Mφ及类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)的共培养体系;以LPS+IFN-γ诱导MφM1极化,并将细胞分为空白对照组,模型组,5、10、20μg·mL^(-1)PNS组;采用CCK-8法筛选PNS最佳给药浓度;流式细胞术检测M1极化比例;实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测TNF-α、MERTK受体、GAS6配体表达水平;ELISA法检测TNF-α、GAS6分泌水平;Western blot检测MERTK受体总蛋白及磷酸化水平。结果 在单培养条件下,5~20μg·mL^(-1)PNS均可显著抑制M1极化,并上调MERTK表达;在共培养条件下,5~20μg·mL^(-1)PNS同样可显著抑制M1极化并上调MERTK表达,与单培养体系不同的是5μg·mL^(-1)PNS能显著上调HFLS-RA分泌GAS6水平且5、10μg·mL^(-1)PNS处理后MERTK磷酸化水平被显著上调。结论 一定浓度的PNS能显著抑制LPS+IFN-γ诱导的MφM1极化及炎症因子TNF-α的表达水平,其作用机制可能与PNS调节GAS6/MERTK通路表达有关。

三七总皂苷对小鼠Treg细胞分化的影响及其机制初探

目的:观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)对CD_(4)^(+) T细胞向调节性T细胞(Treg)分化的影响,并初步探讨其效应与调节细胞脂肪酸氧化代谢的相关性。方法:分离C57BL/6小鼠的脾细胞并磁珠分选CD_(4)^(+) T细胞进行体外培养,采用CCK-8法筛选PNS的最佳给药浓度并检测其对细胞活力的影响,之后分别设对照组、PNS干预组(5,10,20μg·mL^(-1)),相应药物干预后,流式细胞术检测Treg细胞的比例,ELISA方法检测上清液中β-羟基丁酸(BHBA)水平,q-PCR方法检测细胞肉毒碱棕榈酰转移酶1A(CPT-1A)mRNA表达水平,Western Blot法检测细胞中CPT-1A蛋白表达水平。结果:5,10,20μg·mL^(-1)的PNS可显著增加CD_(4)^(+) T细胞向Treg细胞分化的比例,明显增加细胞上清液中BHBA水平,升高细胞中CPT-1A mRNA和CPT-1A蛋白的表达水平。结论:一定浓度的PNS可显著促进小鼠CD_(4)^(+) T细胞向Treg细胞分化,其作用机制可能与提高CD_(4)^(+) T细胞脂肪酸氧化代谢水平有关。