昼夜温差处理下铁皮石斛原球茎松柏苷和紫丁香苷含量的测定

研究不同昼夜温差对铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量的影响,为开发铁皮石斛原球茎作为药材提供研究基础。采用光照培养箱设置不同温差处理,采用超高效液相色谱法测定松柏苷、紫丁香苷含量变化。建立同时测定松柏苷和紫丁香苷的超高效液相色谱法,以ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)为分析柱;流动相:1%乙酸水溶液(A)和甲醇(C)。正交试验研究提取方法,结果表明用纯水提取,料液比1∶40,提取1 h(每0.5 h震荡一次),2种物质提取率最高。采用此方法测定4个昼夜温差处理的铁皮石斛原球茎样品,结果表明,对照0℃温差松柏苷、紫丁香苷整体变化趋于平缓,8℃温差处理下,松柏苷和紫丁香苷在10 d的处理周期下都表现出含量增加,且明显优于其他处理。4℃温差处理两物质含量在第15天达到最高,12℃温差处理两物质含量前期高于对照处理,处理后期低于对照处理,且低于4℃、8℃温差处理。昼夜温差影响铁皮石斛原球茎松柏苷、紫丁香苷含量,一定范围内的温差呈现促进作用,温差过大则出现抑制作用。

温差对铁皮石斛原球茎生长及药用成分的影响

[目的]探讨温差对铁皮石斛原球茎生长及药用成分的影响。[方法]以25℃/13℃为处理温差,恒温25℃/25℃(培养室最常用温度)为对照,昼夜温度设置各12 h,观察和测定铁皮石斛原球茎在0~50 d内的生长情况、生物量、多糖含量、多糖总量、生物碱的变化。[结果]温差有利于铁皮石斛PLBs的增殖、促进生物量增加和多糖积累,长时间的恒温处理则有利于生物碱积累。[结论]该研究为原球茎替代野生植株进行工厂化生产提供了依据。

文心兰25条miRNA前体序列特性及其表达分析

为了解文心兰miRNA的序列特性及其在不同组织部位中以及软腐病侵染过程中的表达规律,该研究对文心兰转录组及miRNA数据库中的25条miRNA前体(pre-miRNA)序列和15条成熟体序列进行序列特性分析,并对25条pre-miRNAs在文心兰不同组织部位及软腐病侵染的假鳞茎中的表达情况进行实时荧光定量分析。结果显示:(1)文心兰25条pre-miRNAs序列可分为13个家族,其中包含15条成熟体序列。(2)Mfold二级结构预测显示,文心兰25条pre-miRNAs的最小折叠自由能在-32.04～-120.98kal/mol之间,均可以形成典型、稳定的发夹结构。(3)序列比对分析发现,同一家族的前体与成熟体存在一个约20个碱基长度的保守区域,推测该区域可能为文心兰miRNA成熟体所在区域。其中,13个前体家族中,有10个家族的成熟体可以完全定位于其前体中。(4)实时荧光定量PCR结果显示,在文心兰不同组织部位中,miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR167-unigene0002619、miR169-unigene0022341、miR172-unigene006514、miR396-unigene19032、miR398-unigene0009996、miR2950-unigene0006151、miR2950-unigene0006422等pre-miRNAs在叶片中大量累积可能有利于其叶的形态建成;miR162-unigene0003615、miR162-unigene0013441、miR166-unigene0011870、miR168-unigene0009958等pre-miRNAs同时在根和叶中均大量表达有利于其根和叶的发育;而miR171-unigene0045985、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180在根和茎中的大量表达可能有利于其根和茎的发育。(5)在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎的过程中,miR159-unigene0037857、miR167-unigene0011236、miR396-unigene0011179、miR396-unigene0011180、miR396-unigene0019032、miR845-unigene0012489的表达总体呈下降趋势;miR162-unigene0040566、miR166-unigene0011870、miR168-unigene0009958、miR171-unigene0045985在软腐病菌液侵染4h其表达量升高,之后表达量下调;miR162-unigene0003615、miR167-unigene0002619、miR168-unigene0047942、miR169-unigene0022341、miR845-unigene0012489在菌液侵染过程中其表达量呈现先下降后上升的趋势,并在侵染8h后表达量达到最低。研究表明,文心兰pre-miRNAs 13个家族不同成员在进化进程中具有高度保守性与特异性的结构特点,并可能广泛参与文心兰不同组织的生长发育及参与软腐病菌侵染的响应。

文心兰PAD4基因克隆及表达分析

为了研究文心兰(Oncidium hybridum)抗病相关基因PAD4在文心兰抗病种质资源培育中的功能,采用RT-PCR结合RACE法,从巧克力文心兰(Oncidium Sharry Baby ‘Sweet Fragrance’)中克隆得到一条全长2 214 bp的基因的cDNA序列,开放阅读框长1 894 bp,预测可编码647个氨基酸,5′UTR长度为65 bp,3′UTR长度为255 bp。生物信息学分析表明:PAD4编码的蛋白属于水解酶超家族,有6个跨膜螺旋,无信号肽,亚细胞定位预测其主要定位于细胞质膜上。系统进化树表明,文心兰PAD4与同为兰科植物的小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsisequestris)、铁皮石斛(Dendrobium catenatum)、深圳拟兰(Apostasia shenzhenica)亲缘关系最近。同源分析结果显示,与铁皮石斛的PAD4蛋白同源性最高(78.08%)。实时荧光定量PCR分析显示,PAD4在文心兰不同组织部位中都有表达,在假鳞茎中的表达量最高,其次是下端叶,在根中的表达量最低。接种软腐病病原菌显示,PAD4在感病文心兰中表达量上调,侵染后4 h时快速响应并达到最高值。SA(salicylicacid)和CaCl2都能够诱导PAD4的表达,都在24h时达到最高峰。研究表明,PAD4基因可能在文心兰抗病过程中有重要作用。

铁皮石斛咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)密码子偏好模式分析

咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是木质素合成过程的关键酶,参与苯丙烷代谢。了解铁皮石斛COMT(Caffeic acid-O-methyltransferase)基因密码子的偏好性可为其功能和分子进化研究提供科学依据。采用Codon W、EMBOSS、SPSS、Origin等分析铁皮石斛COMT的密码子偏好参数,并通过ENC绘图、中性绘图和PR2-plot分析探讨COMT基因密码子偏好性形成的可能因素,同时使用SPSS19.0和MEGA6.0进行聚类分析。结果显示,铁皮石斛COMT基因ENC值、GC含量以及GC3分别为49、0.452和0.396,表明其密码子偏好性较弱,偏好使用A或T结尾的密码子;ENC、中性绘图分析显示突变压力是COMT密码子偏好性形成的主要作用力;铁皮石斛COMT基因和同为兰科植物的香味蝴蝶兰(Phalaenopsis bellina)的亲缘关系最近,两者的GC1s、GC2s、GC3s、GC、CAI和ENC也较为相近,表明物种进化关系上越相近其密码子偏好性也较为相似,但有些物种仍存在一些差异。此外,从密码子使用频率分析得出酵母菌真核表达系统适合铁皮石斛COMT基因的异源表达,模式植物烟草、番茄可以作为其遗传转化受体。本研究为COMT基因功能进一步研究提供参考。

文心兰15个miRNAs及其候选靶标的表达特性

为了解miRNAs及其候选靶标在文心兰不同组织部位及假鳞茎受软腐病病原菌侵染中的表达规律,基于文心兰转录组和miRNA数据库进行分析,从中筛选获得15个miRNAs,结合生物信息学法对其候选靶标进行预测和功能注释,并利用实时荧光定量技术检测miRNA及候选靶标在文心兰不同组织部位和假鳞茎受软腐病病原菌侵染的表达情况.结果表明,文心兰miRNA数据库的miRNA reads分析提示15个miRNAs不同成员可能在文心兰正常植株和感病不同阶段中差异表达. psRNATarget靶标预测显示,文心兰15个miRNAs有828个候选靶标,其中67个可能与抗病相关,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白、F-box蛋白基因、锌指蛋白、RGA抗病蛋白等.基于文心兰miRNAs读取次数(Reads)和Unigene候选靶标RPKM值,发现miRNAs及其候选靶标在文心兰正常植株和假鳞茎不同感病时段表达均存在差异.实时荧光定量PCR分析显示,在文心兰不同组织部位中,miR159a、miR167b、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a均在假鳞茎和叶中均大量表达,并与对应候选靶标的表达呈负调控关系,推测它们参与假鳞茎和叶的发育和形态建成.在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎中,miR159a、miR168a、miR169a、miR171a和miR172a在8 h处理时表达量高,并且与对应的候选靶标在侵染0-8 h表达呈负调控关系,推测上述miRNAs通过负调控候选靶标在中期响应软腐病病原菌侵染过程;而miR167b在处理0h高表达,并且与候选靶标在侵染0-8h表达呈负调控关系,推测其通过下调表达参与软腐病病原菌侵染过程的响应.上述研究表明,文心兰miRNAs通过介导候选靶标的裂解可能广泛参与文心兰不同组织的发育及软腐病病原菌侵染过程的响应.

苋菜中甜菜红素代谢相关基因AmMYB2的表达与功能分析

为了研究AmMYB2基因在苋菜(Amaranthus tricolor)甜菜红素合成中的作用,对红色苋菜品种‘大红’AmMYB2(登录号为KY814751.1)进行生物信息、基因表达及功能分析。结果表明:AmMYB2的开放阅读框(ORF)全长为678 bp,编码蛋白分子质量为25.96 kD,该蛋白具有R2R3型MYB结构域,属于R2R3型MYB转录因子。核酸序列分析结果显示,AmMYB2与甜菜红素合成相关的甜菜BvMYB1和苋菜AmMYB1的相似度分别达到62.11%和49.93%。亚细胞观察显示,AmMYB2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量(qPCR)分析发现,AmMYB2在红色苋菜品种的表达量高于绿色苋菜品种;在‘大红’苋菜中,不同组织以及叶片不同部位中AmMYB2的表达量与甜菜红素含量成正比。构建AmMYB2过表达载体,将其转入烟草和拟南芥中,发现该基因能够在这两种植物中高水平表达,但不会引起颜色变化,揭示AmMYB2可能是苋菜中甜菜红素合成的正调控因子,可能不参与花青素的合成。