心肌肌钙蛋白基因中连续AGG的同义替换与GST融合表达

目的获得高表达、易纯化的GST-cTnT融合蛋白,初步探讨其免疫反应性。方法(1)PCR扩增心肌肌钙蛋白T基因cDNA及其连续稀有密码子的同义替换;(2)PGEX-4T-3/TnT-1、2、3、4的构建与GST-cTnT融合蛋白的表达和纯化;(3)WesternBlot与电化学发光cTnT测定法研究GST-cTnT融合蛋白的免疫反应性。结果成功构建了PGEX-4T-3/TnT-1、2、3、4的表达载体。BL21-PGEX-4T-3/TnT-2、3、4表达的目的蛋白高于BL21-PGEX-4T-3/TnT-1,通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析得到高纯度的融合蛋白。WesternBlot与电化学发光cTnT测定法表明表达的融合蛋白和相应的抗体相互作用,且GST蛋白不与相应的抗体作用。结论cTnT基因上的连续稀有密码子的同义替换,可提高其在E.Coli中的表达量。GST-cTnT融合蛋白中的GST蛋白不影响cTnT的免疫反应性。

TnI(84-330bp)稳定区基因的克隆及表达

目的克隆与表达具有稳定免疫反应性的肌钙蛋白TnI(28-110aa)片段。方法(1)PCR从心脏cDNA中扩增TnI(84-330bp)与PGEX-4T-3/TnI(84-330bp)表达载体的构建;(2)IPTG诱导BL21-PGEX-4T-3/TnI(84-330bp)表达,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)判定pGEx-4T-3-TnI84-330bp融合蛋白的表达情况,并经蛋白质印迹试验(WesternBlotting)对表达产物进行验证。谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化目的蛋白。结果PCR扩增出TnI(84-330bp)基因,将该基因正确地克隆到表达性载体质粒pGEX-4T-3中;可溶性表达的目的蛋白多于包涵体;肌钙蛋白I单抗能识别融合蛋白,而与GST蛋白不发生交叉反应。结论成功构建了能在BL2l中高效表达的PGEX-4T-3/TnI(84-330bp)质粒,表达的目的蛋白有特异免疫反应性。