致泻性大肠杆菌基因芯片检测方法的建立

建立一种多重PCR技术结合基因芯片检测方法,实现多种致泻性大肠杆菌(EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157)的快速、准确检测。筛选肠致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌及大肠杆菌O157的特异基因作为目的基因。设计9对引物和23条探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有特异探针的芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类及型别。该基因芯片可特异性的检测EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157,具有良好的特异性,致病菌检测灵敏度可达104cfu/mL。所建立的多种致泻性大肠杆菌基因芯片方法检测方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。

口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立同时检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒的多重荧光RT-PCR检测方法。方法根据口蹄疫病毒3D蛋白编码基因、水泡性口炎病毒N蛋白编码基因和猪水泡病病毒VP1蛋白编码基因的高保守区设计特异性引物和探针,对3种动物病毒进行多重荧光定量RT-PCR扩增。结果经过扩增,可以同时检测口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒和猪水泡病病毒,而其他参试病原均无扩增信号,显示其良好的特异性。对口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、猪水泡病病毒的最低检测限分别达到101、102、102个质粒拷贝浓度。结论本方法灵敏度高,特异性良好,可实现多种病毒混合感染的同时检测。

恒河猴源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性和致病性

为了查明引起海口市某进境实验动物隔离场3例恒河猴死亡的原因,本试验分别采集3只恒河猴的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结样本,进行细菌分离,通过细菌形态特征、显微镜镜检、生化鉴定、16S核糖体RNA(16S rRNA)序列分析对分离菌进行病原学鉴定;采用纸片扩散法(K-B法)测定分离菌的耐药表型;采用玻片凝集法测定分离菌的血清型;采用动物回归试验分析分离菌的致病性。结果显示,从3只恒河猴上各分离鉴定出1株大肠杆菌,命名为H01株(分离自脾脏)、H02株(分离自淋巴结)和H03株(分离自肝脏);3株大肠杆菌对12种常用抗菌药物产生不同程度耐药,并且都呈现多重耐药,其中对阿莫西林、庆大霉素、氯霉素、氟苯尼考和复方新诺明表现为耐药,仅对阿莫西林-克拉维酸钾、阿米卡星和多黏菌素B表现敏感;玻片凝集试验显示,H01株的血清型为O8,H02株的血清型为O3,H03株的血清型为O9;动物回归试验显示,3株分离菌都是强毒株。本试验为实验动物恒河猴源大肠杆菌病的防治提供参考依据。

尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL^4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL^5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

浅析食品防腐剂的安全应用

介绍了食品防腐剂的分类、研究现状,分析了食品防腐剂所产生的食品安全问题,分析表明要保证食品防腐剂的使用安全,短期内我们可以采取完善法规、严格监管和加强认识的措施,但从长远来看,通过天然防腐剂的开发利用,逐渐代替化学防腐剂,才是解决食品防腐剂安全问题的根本途径。

ELISA、AGID和PCR方法检测牛白血病的比较试验研究

为比较ELISA、AGID和PCR方法检测牛白血病的检出率和符合率,本试验采用这三种方法对隔离期间总数为3998头的乌拉圭进口奶牛进行了牛白血病检测。试验结果表明,对奶牛的牛白血病检测以ELISA方法检出率最高,检出牛白血病抗体阳性牛23头,检出率为0.58%(23/3998);AGID方法检出牛白血病抗体阳性牛18头,检出率为0.45%(18/3998),与ELISA方法的符合率为78%;而PCR方法检出牛白血病前病毒核酸阳性牛12头,检出率为0.30%(12/3998),与ELISA方法和AGID方法的符合率分别为43%和55%。

嗜肺军团菌15种血清型基因芯片检测方法的建立

建立一种多重PCR技术结合基因芯片检测方法,实现嗜肺军团菌15种血清型的快速、准确检测。根据嗜肺军团菌15种血清型的O抗原特异性基因设计并筛选合适的引物和探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有特异探针的芯片杂交。用扫描仪扫描,判定嗜肺军团菌的血清型。该基因芯片可特异性的检测嗜肺军团菌的15种血清型,具有良好的特异性,芯片纯菌DNA检测灵敏度为10ng。所建立的嗜肺军团菌15种血清型基因芯片检测方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。

H7N9禽流感病毒等温扩增快速检测方法的建立

目的建立H7N9禽流感病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法从GISAID数据库中获得H7N9禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用PrimerExplorer V4软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物、内引物,同时以所克隆的阳性质粒为模板,建立H7N9禽流感病毒等温扩增快速检测方法。结果LAMP检测方法对H7N9禽流感病毒的灵敏度达到10个拷贝,所用引物对于H1、H3、H5亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增,表现出良好特异性。结论建立的H7N9禽流感病毒等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强,为快速检测禽流感病毒提供了新方法。

活体动物中大环内脂类残留检测微生物抑制法的建立

[目的]建立活体动物中大环内酯类残留的检测方法。[方法]采用微生物抑制方法,对藤黄微球菌CMCC 28001的选择性和特异性、样品提取方法、平板制备条件、方法检出限等技术参数进行研究。[结果]建立的方法可用于活体动物中红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素、林可霉素、吉他霉素和克林霉素等6种大环内脂类药物的残留检测。当菌悬液添加浓度为10^(-3)倍稀释液(5.5×106CFU/m L)以及培养基PH值为7.5且培养温度为30℃时,可产生直径最大,边缘光滑、完整、清晰的抑菌圈。[结论]该方法具有良好的敏感性和重复性,成本低,操作简便,是色谱分析、免疫分析等其它方法的有益补充。

鉴别猪瘟病毒强毒和疫苗弱毒的RT-PCR检测方法的建立

根据Genbank上发表的猪瘟病毒(CSFV)全基因组序列,选择猪瘟强毒株和兔化弱毒疫苗株序列存在的差异区域,分别设计合成两条特异性的上游引物,一条只针对强毒毒株,一条只针对兔化弱毒疫苗株;同时选择高保守区域序列,设计合成了一条强毒和兔化弱毒共用的下游引物,成功建立了一种能够区分猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。应用该方法从猪瘟强毒株和兔化弱毒株中扩增出了大小分别为680bp和785bp的特异性片段。该方法对PRRSV、BVDV、PRV、PCV等病毒基因组扩增,结果均为阴性;该方法可以检测出最低为0.5pg的猪瘟病毒RNA,具有高度的特异性和敏感性。本方法的建立为猪瘟的实验室检测和流行病学调查奠定了坚实的基础。

一种基于CP204L基因的非洲猪瘟病毒Taq Man-MGB实时荧光PCR检测方法的建立

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)CP204L基因序列设计1对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种检测ASFV的TaqMan-MGB实时荧光PCR方法。结果显示,该方法仅对ASFVDNA呈现特异性扩增,不与猪的其他常见病毒发生交叉反应,具有良好的特异性。该方法对标准对照质粒(PCR2.1-CP204L)的线性检测范围为4.2×10~1~4.2×10~9copies/μL,标准曲线方程为Y=-3.452 3X+39.014,相关系数(R^2)为0.998 8,检测下线为4.2个拷贝。对5个不同浓度(4.2×10~3~4.2×10~7copies/μL)的质粒标准品进行4次双份样品的重复检测,Ct值变异系数均小于1.5%,表明该方法具有良好的重现性。用该方法对总计164份的进口猪临床样品和生猪肌肉样品进行ASFV检测,结果均为阴性。该方法的建立为活猪临床样品和生猪肌肉样品中ASFV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

荧光定量PCR方法检测榛果过敏原成分

目的建立榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法,并将此方法与酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法进行比对实验。方法根据榛果成分oleosin特异性基因设计并筛选合适的引物和探针,优化反应体系和反应条件,建立榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法,对荧光定量PCR方法与ELISA方法检测结果进行分析。结果建立的榛果过敏原成分荧光定量PCR方法特异性良好,可用于榛果过敏原成分的定量检测,但检测灵敏度低于ELISA检测方法。结论所建立的榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度达到10 mg/kg,具有较好的实用性,ELISA检测方法灵敏度高于荧光定量PCR法,但当榛果过敏蛋白被破坏后有可能出现假阴性结果。

基因3型猪戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

对GenBank中基因3型猪戊型肝炎病毒（HEV）代表毒株基因进行序列分析,最终选定ORF3基因的部分序列为目的基因,运用生物信息学软件设计特异性引物和探针,扩增获得目的片段,并构建重组载体p UC-19-ORF3。梯度稀释重组质粒制备标准品,初步建立检测基因3型HEV的实时荧光定量PCR方法。对建立的检测方法进行特异性、敏感性和重复性验证。结果表明,标准品浓度在108～102 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.996。特异性试验结果显示,其它几种常见猪病病原体（猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒）未见典型扩增曲线。敏感性试验证实本方法的最低检测下限为101 copies/μL。重复性试验表明该方法对3个标准品检测结果的批内和批间变异系数低于2%。用该方法抽检59份进境猪肉样品,同时用普通RT-PCR方法对这些样品进行符合性试验,结果均为阴性。本研究所建立的检测方法不仅适用于进境猪肉样品中基因3型HEV的监控检测,而且还可用于基因3型HEV的早期临床诊断及分子流行病学调查。

两种方法检测牛地方流行性白血病的比较

目的分析ELISA方法和AGID方法检测奶牛地方流行性白血病的一致性。方法应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)两种方法,平行检测来自乌拉圭的3998份奶牛血清中的牛白血病病毒抗体。结果 ELISA和AGID对牛地方流行性白血病病毒抗体的阳性符合率、阴性符合率及总符合率分别达到100%(18/18)、99.42%(3975/3998)、99.87%(3993/3998),表明两种方法的符合率较高,均可用于奶牛地方流行性白血病的诊断和血清学筛查,其中ELISA方法阳性检出率高于AGID方法。

猪戊型肝炎病毒检测技术的研究进展

猪戊型肝炎是一种新的人畜共患病,其病原戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是无囊膜的RNA病毒,主要通过消化道进行传播。研究发现,世界上许多国家的猪群中普遍存在HEV抗体及猪戊型肝炎病毒RNA携带。与患病猪群密切接触、食用未煮熟的猪肉或猪肉制品、被污染的水源及水产品,这些因素都可增加戊型肝炎的患病风险。猪作为戊型肝炎病毒的宿主,不仅对公共卫生和食品安全构成威胁,同时对人类戊型肝炎流行病学有很大的影响。本文简要介绍了HEV的病原学以及抗原抗体检测方法,包括血清学、免疫学及分子生物学方法等,并对国内外开展的戊型肝炎检测技术的研究进展进行综述。

多重基因遗传表达分析系统及其应用研究进展

核酸检测技术广泛用于生命科学、微生物学及医学领域。随着分子生物学的发展,在经典技术的基础上研究人员又开发出多种新型检测技术。其中多重基因遗传表达分析系统(gene expression profiler genetic analysis system,Ge XP)技术作为聚合酶链式反应和芯片的换代技术,具有特异性好、灵敏度高的特点,能够同时检测多个目的基因,真正意义上实现了高通量检测。本文详细介绍了Ge XP技术的原理以及优缺点,并对Ge XP技术在畜牧兽医研究、转基因食品检测、微生物检测及医学研究中的应用进行阐述,以期为该技术将来在食品检测方面的推广提供参考。

H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据H1和H3亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（SFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照（SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA）,最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。

微生物抑制法检测活动物红霉素、螺旋霉素残留

采用藤黄微球菌CMCC 28001作为指示菌,用微生物抑制法对活体动物中大环内酯类药物红霉素、螺旋霉素残留进行检测。对菌种的选择性和特异性、样品提取方法、平板制备条件、方法检出限等技术参数进行研究。

A型猪流感病毒TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型猪流感病毒(SIV)的基质蛋白(M)编码基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测A型SIV的荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法对H1N1、H3N2和H9N2亚型SIV均呈特异性扩增,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等猪的其他常见病毒无交叉扩增反应;该方法对M基因RNA对照(SIV-M-RNA)的最适线性检测范围为3.8×10~1~3.8×10~8拷贝数/反应,标准曲线方程为Y=-3.4365X+40.091,相关系数(R^2)为0.999 8,最低检出限为38个拷贝数的SIV-M-RNA。对3个不同浓度(3.8×10~3~3.8×10~5 copies/μL)的SIV-M-RNA进行组间和组内重复试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对860份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪场猪鼻拭子样本进行SIV检测,结果进口猪鼻拭子样本的SIV检测均为阴性,17份国内猪场猪鼻拭子样本SIV检测为阳性。本研究提供了一种快速、敏感和特异的A型猪流感病毒检测方法。

微流控芯片技术检测虾四种病原微生物方法的建立

针对虾的白斑综合征病毒、桃拉综合征病毒、黄头病毒和十足目虹彩病毒1的基因保守序列设计LAMP引物,将引物包被于芯片反应槽中,将微流控芯片技术与LAMP等温扩增技术相结合,建立针对这四种病毒的高效准确检测方法。用不同浓度的病毒阳性模板检测了建立的检测方法对4种虾病毒与另1种常见虾病毒的特异性,并对20份阳性和30份阴性虾组织样本的特异性、敏感性和重复性进行了临床对比验证实验。结果表明:本研究方法灵敏度高,特异性强,重复性好,各病毒间无交叉反应,为同时快速检测虾的四种病毒提供了技术手段。