BHIVgag-pol基因在MT-4细胞中的表达

以HIV 1HXBc2毒株为遗传背景 ,通过DNA重组技术构建出嵌合有BIVR2 9gag pol基因的重组病毒BHIVcDNA .BHIVcDNA经电转染导入人源细胞MT 4后 ,分别收集第 1d到第 7d的细胞和培养液上清进行检测 .RT PCR分析证实BHIV的 gag基因已得到转录 ;反转录酶活性测定表明 ,BHIV中源于BIV的反转录酶已得到正确转录、翻译并加工成熟 .这些结果说明重组病毒BHIVcDNA中HIV控制下的BIV gag pol基因能够在MT

BIV在人源细胞MT-4中的活性研究

牛免疫缺陷病毒 (Bovineimmunodeficiencyvirus,BIV)在分类上属于反转录病毒科的慢病毒属 ,目前尚未见BIV感染人的报道。为进一步确定BIV对人源细胞的感染性 ,我们用BIV12 7cDNA转染人源细胞MT 4 ,通过RT PCR检测到BIVgag基因的转录 ,IFA则显示BIV12 7的 gag或 gag pol基因在MT 4细胞中得到了翻译 ,而RT值的测定也有力地说明BIV12 7cDNA已经在MT 4细胞内表达出有活性的反转录酶 ,但细胞传代实验表明BIV不能在MT

谐波的抑制探讨

本文简要介绍了谐波的产生与危害,有源滤波器与无源滤波器的区别。

滑块联轴器及其应用的运动学问题

用机构学原理,建立了滑块联轴器及其应用时的运动学模型,分析了其产生的位移、速度、加速度和惯性力等运动学问题,并推导出相应的计算公式. 为滑块联轴器的应用与改进提出了必要的理论依据.

中国恒河猴外周血淋巴细胞免疫表型及功能研究

目的通过研究中国恒河猴外周血淋巴细胞免疫表型及其功能,为以恒河猴为模型的研究提供数据参考。方法通过优选抗体克隆和荧光配色,确定了主要淋巴细胞亚群检测和T细胞功能检测Panel,并用此方法分析15只健康中国恒河猴外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中T、B、NK等多种细胞亚群的比例,以及在非特异性刺激条件下T细胞分泌细胞因子的能力。结果成功建立了两套多色流式Panel,Panel 1可同时检测细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte,CTL)、滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)、调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)、B细胞和NK细胞等多种淋巴细胞亚群,Panel 2可检测多种T细胞亚群功能和免疫检查点分子的表达。中国恒河猴PBMCs中主要淋巴细胞亚群比例的平均值分别为T细胞(75.32±7.73)%、B细胞(13.22±7.50)%、NK细胞(0.88±0.48)%、Tfh细胞(0.73±0.27)%、Treg细胞(0.75±0.43)%、CD16+NK细胞(47.87±22.35)%、CD56+NK细胞(10.69±12.41)%。非特异性刺激后,分泌IL-2和TNF-α的CD4+T细胞比例高于CD8+T细胞,分泌CD107a和IFN-γ的CD8+T细胞比例高于CD4+T细胞,而这两种细胞分泌IL-17A的比例均较低。结论本研究建立了可在单细胞水平同时检测多个细胞表面分子和分泌因子的多色流式检测方案,能够准确、全面地分析恒河猴PBMCs中免疫细胞亚群、免疫功能以及免疫检查点分子的表达,为利用恒河猴模型进行传染病疫苗及药物研发提供新的实验方法和基础数据。

新冠灭活疫苗序贯免疫对Wuhan-Hu1和Omicron变异株的体液免疫反应

目的研究新冠灭活疫苗序贯免疫策略对Wuhan-Hu1和Omicron变异株中和抗体的影响。方法BALB/c小鼠免疫两针Wuhan-Hu-1灭活疫苗,再分别用Omicron或Wuhan-Hu-1灭活疫苗加强免疫,采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清结合抗体水平;用水疱性口炎病毒假病毒检测系统检测小鼠血清中Omicron变异株中和抗体水平;采用酶联免疫吸附斑点实验检测特异性T细胞反应。结果与免疫一针Wuhan-Hu1灭活疫苗相比,免疫两针疫苗提高小鼠血清特异性Wuhan-Hu1、Delta和Omicron受体结合域(receptor binding domain,RBD)IgG滴度。与加强免疫Wuhan-Hu1灭活疫苗组相比,小鼠加强免疫Omicron灭活疫苗后,血清Wuhan-Hu1和Omicron特异性结合抗体RBD IgG GMT分别提高1.41和1.26倍;针对Omicron变异株BA.1、BA.2、BA.4/5和BF.7的中和抗体GMT分别提高4.5、3.4、12.1和6.5倍。加强免疫Wuhan-Hu1或Omicron灭活疫苗后,小鼠血清Wu-RBD IgA滴度高于免疫一针Wuhan-Hu1灭活疫苗(P=0.0057,P=0.0061)。结论加强免疫Omicron灭活疫苗能提高Omicron变异株的中和抗体水平。Wuhan-Hu1或Omicron灭活疫苗加强免疫能显著增强小鼠诱导的Wuhan-Hu1 RBD IgA。

以化学合成和体外转录RNA为参考品的SIV/SHIV RNA定量检测方法比较研究

目的比较化学合成与体外转录的RNA作为参考品定量检测SIV/SHIV RNA的重复性、稳定性及灵敏度,建立一种实时、灵敏、特异的SIV/SHIV RNA载量检测方法。方法用化学合成的方法合成91个核苷酸(nucleotide,nt)的SIV/SHIV Gag RNA;用带T7启动子的特异性引物逆转录SHIVSF162 P3的基因组RNA,得到带T7启动子的DNA序列后,经体外转录合成385 nt Gag RNA。将两种RNA分别进行10倍系列稀释,通过一步法TaqMan探针荧光定量逆转录PCR(quantitative Real-time reverse transcription PCR;qRT-PCR)测定标准曲线和扩增曲线,10次独立实验重复测量,对比两种RNA的灵敏度和重复性,检测在4℃和25℃分别放置3 h、6 h和9 h后的两种RNA的扩增曲线和Ct值,比较两种RNA的稳定性。结果体外转录RNA组中,相同浓度复孔的扩增曲线重合度高,各浓度Ct值线性关系较好,标准曲线方程为:Y=-3.709x+49.143,R2=0.999,检测灵敏度为5.5×103拷贝/ml,10次重复测量的平均变异系数仅为2.24%;而化学合成RNA组的标准曲线方程为:Y=-4.014x+53.108,R2=0.944,检测灵敏度为5.5×104拷贝/ml,10次重复测量的平均变异系数为5.33%。体外转录RNA组检测结果的稳定性、重复性和灵敏度更高。结论使用体外转录RNA作为参考品,建立的检测方法的灵敏度、特异性、重复性及稳定性均优于化学合成的RNA,用该参考品建立的一步法TaqMan探针qRT-PCR检测方法可用于SIV/SHIV RNA载量分析。

牛泡沫病毒内部启动子上顺式作用元件具有增强子特性

以牛泡沫病毒（bovine foamy virus,BFV）中国毒株 BFV3026为材料,研究env基因内部启动子（internal promoter,IP）上顺式作用元件的功能特点.用PCR方法进行系列缺失,将IP中BFV反式激活因子 Tas应答元件（TREIP）精确定位于 TATA盒近上游的 72bp区段中（9205～9276）.发现此段可激活同源及异源启动子,具有典型增强子特性;此区段与已知SFV-1TREIP近启动子区和 SFV-3 TREIP序列同源性高,都具有核因子 NF-1（nuclear factor1）的结合位点,位置相同,推测此类顺式作用元件具有相似功能特点.

表达 HIV-1建立感染相关病毒（T／F）膜蛋白的重组痘病毒与蛋白疫苗联合免疫豚鼠后体液免疫特征研究

目的：研究表达HIV-1建立感染相关病毒（ T／F）膜蛋白的重组痘苗病毒rTT-B、rTT-C和rTT-CON与gp140蛋白疫苗联合免疫豚鼠后抗体反应情况。方法采取Prime-boost免疫策略对豚鼠进行rTT初免1次，间隔4、8周后gp140蛋白疫苗加强免疫2次。免疫前和末次免疫后2、6、10周采豚鼠血，检测血清中HIV-1特异性结合抗体、中和抗体以及抗体的相对亲和力。结果（1） rTT-B、rTT-C和rTT-CON三种病毒和蛋白联合免疫均诱导了强烈的针对HIV-1 B′／C、B、AE亚型特异性结合抗体，抗体滴度范围为111430～1024000，其中，rTT-C和rTT-CON和蛋白联合免疫2周后诱导的B′／C和AE亚型特异性抗体滴度显著高于rTT-B（P＜0．05），但3种病毒蛋白联合免疫诱导的B亚型膜蛋白特异性抗体滴度差异无统计学意义。（2）3种病毒蛋白联合免疫都能诱导较强滴度针对SF162和ZM109的中和抗体，抗体滴度范围为83．76～649．30，3种病毒间差异无统计学意义。（3）3种病毒蛋白联合免疫都能诱导与免疫保护有关的HIV-1 V1V2-gp70特异性抗体，3种病毒间差异无统计学意义。（4）3种病毒蛋白联合免疫诱导的抗体对HIV-1 B′／C、B、AE亚型膜蛋白具有较强亲和力，3种病毒间差异无统计学意义。结论重组痘苗病毒rTT-B、rTT-C和rTT-CON与gp140联合免疫豚鼠后可以有效诱导出针对同源和异源病毒膜蛋白的结合及中和抗体。

重组痘苗病毒HIV疫苗肌注初免蛋白疫苗滴鼻加强后激发高强度黏膜IgA应答反应

目的研究痘苗病毒载体HIV疫苗和蛋白疫苗联合运用所激发的黏膜免疫应答，探讨不同途径免疫产生黏膜免疫应答的异同，进一步证实MF59佐剂在激发疫苗黏膜免疫应答方面的效果。方法以表达HIV-1中国流行株CN54 Gag—Pol—Env基因的重组痘苗病毒天坛株rTV，重组HIV-1膜蛋白gp140三聚体为抗原，辅以水包油型佐剂（oil—in—water）MF59，在小鼠模型上，通过不同免疫途径组合联合免疫BALB／c小鼠，即重组痘苗病毒初免，免疫途径为滴鼻或肌注，gp140与MF59混合物加强免疫，免疫途径为滴鼻、肌注或皮下，探讨能诱导高效黏膜免疫应答的免疫策略。通过ELISA方法对小鼠血清中HIV-1特异性的IgG和IgA及唾液和阴道分泌物中IgA进行检测。结果MF59是一种良好的黏膜佐剂，能显著增强HIV蛋白疫苗的黏膜免疫应答，所激发的黏膜IgA滴度与鞭毛素蛋白（SF）和霍乱毒素B亚单位（CTB）的黏膜佐剂活性相当；重组痘苗病毒初免（肌注），gp140与MF59加强（滴鼻）联合免疫策略能诱导高水平的血清IgA和黏膜IgA抗体（P〈0．05），其抗体滴度分别高达1：15000和1：600。结论重组痘苗病毒天坛株rTV系统途径免疫小鼠后蛋白疫苗黏膜途径加强能激发高强度黏膜免疫应答，这一免疫策略及组合可为阻断通过口腔和阴道黏膜传播的艾滋病疫苗研究提供参考。

表达EIAV Gag蛋白的DNA载体与重组痘苗病毒联合免疫效果的观察

将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag.Westernblot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAVGag蛋白.使用本实验室构建的表达EIAVDLV和LNGag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠,结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答.统计学分析显示,联合免疫组与单独免疫组相比,诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化,而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强,CTL杀伤率最高可达31%,DLVGag蛋白与LNGag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异.研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制,并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础.

C D4＋T 细胞剔除对复制型重组痘苗病毒免疫原性及毒力的影响

目的：探讨CD4＋T细胞剔除对复制型重组痘苗病毒免疫原性及毒力的影响。方法BALB／c小鼠经腹腔注射CD4单克隆抗体剔除CD4＋T细胞后，尾部划痕接种重组痘苗病毒rTV或天坛株VTT，同时设正常小鼠对照。免疫后定期观察小鼠体重变化和接种部位痘斑变化，并检测病毒排出量和CD4＋T细胞比例。免疫后第28天处死小鼠，检测小鼠体液和细胞免疫，取卵巢组织检测病毒滴度。结果 CD4＋T细胞剔除小鼠和正常小鼠在接种rTV或VTT后均出现典型的种痘后局部反应，但均未出现次级或卫星病损。 CD4＋T细胞剔除小鼠的痘斑愈合时间、病毒排出时间及体重恢复时间均长于正常小鼠。 CD4＋T细胞剔除小鼠和正常小鼠的卵巢中均未检测出痘苗病毒。 CD4＋T细胞剔除小鼠的HIV抗体和痘苗病毒抗体平均A值分别为0．119和0．168，显著低于正常小鼠的平均A值（P＜0．05，P＜0．01）。 McAb／rTV组的痘苗病毒中和抗体滴度几何均值为1∶321，显著低于rTV组1∶1286（P＜0．05）。 McAb／rTV组诱导的痘苗病毒特异性IFN-γ＋／CD4＋T效应细胞百分比均值为0．654％，显著低于rTV组（P＝0．0004），但IFN-γ＋／CD8＋T效应细胞百分比与rTV组的差异无统计学意义。结论剔除CD4＋T细胞的小鼠能有效控制重组痘苗病毒的复制和播散。 CD4＋T细胞的剔除显著降低了体液免疫应答和CD4＋T细胞免疫应答，对CD8＋T细胞免疫应答无显著影响。

新型冠状病毒疫苗免疫BALB/c小鼠后的T细胞表位鉴定

目的鉴定携带新型冠状病毒S、N和M基因的疫苗在BALB/c小鼠上的T细胞表位。方法用携带新型冠状病毒S、N和M基因的DNA疫苗和痘病毒载体疫苗免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,末次免疫1个月内取小鼠脾细胞,用ELISPOT法检测其对新型冠状病毒特异性多肽的T细胞免疫反应,筛选出具有阳性反应的多肽片段,并对其表位进行预测分析。结果S、N、M基因分别鉴定出12、2、17条阳性多肽。S基因中多肽S49、S50、S100、S101、S102、S103阳性反应率为100%,且免疫刺激指数最高;覆盖M蛋白全长的41条多肽中有7条能刺激50%以上的小鼠产生阳性反应。预测分析结果显示,S、N、M基因分别有10、1、16个MHC-1 H-2限制性表位,主要位于S基因的RBD区、N基因RBD区以及M基因的跨膜区。这些表位在SARS-CoV-2及其变异株、SARS-CoV中高度保守。结论新型冠状病毒DNA疫苗和痘病毒载体疫苗诱导了针对多个基因、多个表位的特异性T细胞应答,未来通用型疫苗设计应包含能诱导细胞免疫的多个抗原,特别是包含保守表位的结构抗原。

痘苗病毒天坛株C8L—K3L片段缺失表达载体的生物学性能研究

目的研究缺失C8L．K3L片段的痘苗病毒天坛株载体的生物学性能及外源基因的免疫原性。方法构建缺失C8L-K3L区域的重组痘苗病毒天坛株载体VrITT△c8-K3-gag。在4种细胞上检钡0了重组载体的增殖能力、在小鼠和家兔模型上进行毒力评价，并在BALB／c小鼠进行了免疫效果评价。结果与Vrrr相比，VTTAC8-K3-gag在CEF、BHK-21、HeLa细胞中复制能力显著下降，在Vero细胞中失去复制能力。VTYAC8-K3-gag在小鼠和家兔模型中毒力均有显著降低。VTT△C8-K3-gag免疫小鼠第4周后诱导的痘苗病毒特异结合抗体与中和抗体滴度分别达到5．6×10^3和1．0×10^4，第9周滴度弦到5．8×10^5和5．25×10^3，与VTKgpe相比均显著下降3～9倍，但E3刺激后的细胞免疫应答无显著变化。VTT△C8-K3-gag单独免疫或与DNA疫苗联合免疫诱导的HIV特异性抗体水平和细胞免疫应答均与VTKgpe无差异。结论VTrAC8-K3-gag是一个安全性较高且具有深入研究价值的HIV候选疫苗株。

DNA疫苗-重组痘苗病毒-蛋白疫苗联合诱导HIV-1抗体应答免疫程序的优化

比较DNA疫苗、重组痘苗病毒、蛋白疫苗不同免疫组合及免疫间隔时间对免疫效果的影响。采取Primeboost-boost免疫程序对豚鼠进行DNA疫苗初免三次,重组痘苗病毒rTV加强一次,分别间隔4、8、12周后免疫gp140蛋白加强免疫两次;同时,采取Prime-boost免疫程序重组痘苗病毒rTV初免一次,分别间隔4、8、12周后加强免疫gp140蛋白二次。末次免疫后不同时间点采血检测豚鼠血清中HIV-1特异性结合抗体、中和抗体以及抗体的相对亲合力。DNA-rTV-gp140免疫策略诱导的HIV-1gp140/gp120抗体滴度、相对亲合力以及V1V2-gp70抗体OD值均高于rTV-gp140。对DNA-rTV-gp140免疫策略而言,间隔12周的免疫策略较间隔4周诱导了更高的V1V2-gp70抗体,而间隔4周更有利于提高抗体亲合力。rTV-gp140免疫策略间隔8或12周诱导的体液免疫更为理想。DNA疫苗初免,rTV和蛋白疫苗依次加强能够诱导更强的体液免疫,较长的免疫间隔有利于诱导V1V2-gp70抗体,较短的间隔有利于提高抗体亲合力。

缺失C8-K3片段重组天坛痘苗病毒的免疫策略研究

目的探索不同的DNA疫苗初免-重组痘苗病毒加强免疫策略的效果,为建立最佳免疫方案提供依据。方法对小鼠进行DNA疫苗初免,之后分别加强免疫一针、两针和三针重组痘苗病毒VTT△C8-K3-gag,在不同时间点采取血样及制备脾细胞,检测针对痘苗病毒和HIV特异性体液免疫及细胞免疫应答。结果三种免疫策略中,DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两次的效果最佳,诱导的针对p55的结合抗体滴度达到106,分泌IFN-γ的T细胞数为342/106细胞。针对痘苗病毒的体液和细胞免疫应答显著低于加强免疫三针诱导的免疫反应。结论DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两针可诱导较高水平的HIV免疫应答,同时保证了较低水平的载体免疫反应。

复制型重组痘苗病毒TTK-EG特异性T细胞表位研究

目的筛选和确定TTK-EG包含的H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位。方法 6~8周龄雌性BALB/c小鼠0周时分别经肌肉注射、皮内注射和滴鼻途径免疫5×10~6PFU TTK-EG,间隔4个月进行加强免疫。末次免疫后2周取小鼠脾细胞,采用IFN-γELISPOT方法筛选HIV-1 Env和Gag肽库,反应阳性的肽库进行第二轮单肽筛选。用流式细胞术(胞内因子染色,intracellular cytokine staining,ICS)对筛选出的单肽进行验证(小鼠免疫途径为肌肉注射),确定H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位。结果经过ELISPOT筛选和ICS验证,确定2条Env多肽(gp140-9,氨基酸位点60~77;gp140-74,氨基酸位点548~565)和3条Gag多肽(Gag-49,氨基酸位点196~210;Gag-64,氨基酸位点256~270;Gag-65,氨基酸位点260~274)包含H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位,其中gp140-74(IVQQQSNLLRAIEAQQHL)是首次发现的H-2~d限制的HIV-1特异性T细胞表位。Env、Gag优势表位肽与Env、Gag全肽池刺激小鼠T细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α三种细胞因子的能力基本相同。结论 Env多肽gp140-9、gp140-74和Gag多肽Gag-49、Gag-64、Gag-65包含H-2~d限制的T细胞表位,可用于重组痘苗病毒TTK-EG的T细胞免疫研究。

耐热纤维素酶产生菌及产酶条件

从西双版纳温泉水样中分离经鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌的ＣＣ２２菌株（ＢａｃｉｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｓｔｒａｉｎＣＣ２２）在６０℃生长时，培养液中可积累耐热的ＣＭＣａｓｅ（４３ｍＵ／ｍＬ）和ＦＰａｓｅ，（１０６ｍＵ／ｍＬ）．产酶高峰期在培养１６ｈ左右，最适起始ｐＨ为６．５，温度为６０℃．ＣＣ２２能利用某些无机氮形成纤维素酶，一定配比的有机氮和无机氮的混合物是ＣＣ２２形成纤维素酶的最好氮源．ＣＭＣＮａ纤维二糖及一些农作物原料能作为碳源供ＣＣ２２形成纤维素酶，高浓度葡萄糖对ＣＣ２２纤维素酶的形成有抑制作用．１５ｇ／Ｌ的ＮａＣｌ对ＣＣ２２产酶有抑制作用，但体积分数为１％的６号微量矿质营养液无论对菌的生长和产酶均有显著促进作用．

热杆菌素YN8674的初步纯化和部分理化性质

采用离心、过滤、浓缩、葡聚糖凝胶柱层析等方法对热杆菌素YN86 74进行了初步纯化 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初步纯化样品还有两条谱带 .研究了初步纯化样品对热、4℃贮存期、pH和用五种酶处理后的剩余活性 .结果表明 ,热杆菌素YN86 74是一种极其稳定的抑菌物质 ,经 12 1℃、15磅高温高压处理 30min后还残存 3.1%的活力 ,抑菌圈仍清晰可见 ;4℃冰箱中贮存 6 0d ,其活性几乎不受损失 ;经核糖核酸酶、纤维素酶、溶菌酶、胰蛋白酶和α -淀粉酶处理后的热杆菌素YN86 74活性变化很小 ,说明热杆菌素YN86 74对这五种酶不敏感 .这些结果提示 :热杆菌素YN86 74不仅在性质上极其稳定 ,在结构组成上可能也很特殊 .

嗜热脂肪芽孢杆菌YN8674热杆菌素产生条件和过程

采用多因子正交试验方法 ,确定了一组YN86 74热杆菌素产生的优化组合培养基 ,发现培养基中的碳源和无机盐对热杆菌素YN86 74产量影响最大 .通过对热杆菌素YN86 74产生条件研究 ,发现热杆菌素产生的最适培养温度是 6 0℃ ,最适初始 pH是 6 .5 ,而菌体生长的最适培养温度是 6 5℃ ,最适初始pH是 7.0 .热杆菌素YN86 74是在菌体生长到对数期中期开始产生 ,与菌体的生长、发酵液 pH的变化密切相关 .