磷酸化蛋白质分析技术在蛋白质组研究中的应用

磷酸化修饰蛋白质的分析是蛋白质组研究中的重要内容。对于目前磷酸化蛋白质分析所涉及的各种方法,包括放射性同位素标记,抗体免疫印记等传统方法和以串联质谱各种扫描技术为基础,结合亲和提取、液相色谱质谱联用等手段的新技术、新方法,以及这些技术在磷酸化蛋白质组学中的应用予以评述。

亲和毛细管电泳技术及其应用

对近几年新发展起来的亲和毛细管电泳技术（ACE）的原理、分类及方法作了简要介绍，着重介绍了亲和毛细管区带电泳、毛细管亲和凝胶电泳、胶束电动色谱中的亲和电泳、亲和毛细管等电聚焦、亲和探针毛细管电泳等过程和方法。对ACE在分子生物学、生物化学中的应用及该技术在亲和常数测定、核酸片段识别、竞争免疫分析、药物先导化合物的筛选等方面的应用也作了介绍。

烯丙孕素在母猪批次化生产中的应用

非洲猪瘟疫情给我国养猪业造成深远的影响,众多复养场在复养过程中采用批次化生产方式。目前,烯丙孕素是批次化生产的关键外源激素,主要应用于后备母猪和乏情经产母猪的同期发情。随着批次化生产在我国的不断推广,烯丙孕素应用越来越广泛。本文阐述烯丙孕素在母猪批次化生产中的应用,以期为生产实践提供参考。

不同诱情方式对后备母猪诱情效果及繁殖性能的影响

后备母猪是猪场生产的基础,是决定整个猪群生产水平的关键。情期管理对种猪产出至关重要。本文对比了不同诱情方式对后备母猪诱情效果及繁殖性能的影响,发现公猪诱情组和人工刺激组均显著提高后备母猪的发情率和繁殖性能,且公猪诱情组的提高幅度高于人工刺激组,但二者差异不显著,在非洲猪瘟发生后公猪紧缺的时期值得推广应用。

蛋白质组学研究中的色谱分离技术

多维色谱 质谱技术正逐渐成为蛋白质组学研究的重要技术平台。对该技术及其应用的最新发展动态进行了综述,共引用文献59篇。

基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构

建立了生物质谱研究rhEPO一级结构的系列方法,包括分子量、唾液酸含量以及N-糖含量等糖基化性质的测定方法,并用于4种国产rhEPO样品的分析;在此基础上优化酶切条件,使测定的肽质量指纹谱(PMF)的覆盖率均达到98%,成功鉴定了4个样品中的全部N-糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了结构确证,测定4个样品分子量分别为27754.1±27.4Da、27941.4±23.2Da、27682.5±22.0Da和27914.7±22.5Da;唾液酸含量分别为5.0%、4.8%、5.6%和5.4%;糖含量分别为34.3%、34.7%、34.1%和34·6%。此外还对4种产品在O-连接糖型及N-连接糖型上的区别做了初步探讨。

翻译后修饰蛋白质组学研究的技术策略

蛋白质组学早期研究的绝大部分工作是在关注细胞不同生长时期或是疾病、分裂素刺激下的蛋白质表达水平变化.然而,许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相对丰度控制,更重要的是被那些时空特异分布的可逆翻译后修饰控制的,揭示翻译后修饰发生规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提.由于翻译后修饰蛋白质在样本中含量低且动态范围广,其相关研究极具挑战性,亲和富集、多维分离等技术与生物质谱的结合为翻译后修饰蛋白质组学的发展提供了契机,目前,已进行规模化研究的蛋白质翻译后修饰主要有四大类,其中磷酸化和糖基化研究较多.本文针对大规模翻译后的修饰蛋白质的分析策略和技术路线,如蛋白质的磷酸化修饰,糖基化修饰,泛素化修饰,基于蛋白质氧化还原状态进行的氧化还原修饰和其它修饰像乙酰化、甲基化、脂基化修饰等进行了综述.

用反相液相色谱分离多肽时峰容量与色谱柱长度关系的研究

在蛋白质组学研究中,多肽混合物的有效分离对蛋白质鉴定和蛋白质之间相互作用的研究起着决定性的影响。基于此,用反相液相色谱研究了在两个不同长度的色谱柱上分离多肽混合物时色谱柱长度与峰容量的关系,同时考察了梯度洗脱时间对峰容量和峰宽的影响。实验结果表明,色谱柱长度对峰容量有显著的影响,而延长梯度洗脱时间不仅可以增加峰容量,而且可以增加峰宽。这说明用毛细管液相色谱 串联质谱联用方法对多肽混合物进行分离鉴定时,采用较长的色谱柱和较长的梯度洗脱时间有利于对更多的多肽进行分析鉴定。

磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰,在生物体内起着极为重要的作用.近年来蛋白质翻译后修饰日益成为蛋白质组研究的热点之一.定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化,更好地了解生物学功能调节网络奠定了坚实的基础.作为蛋白质组学研究的一个重要组成部分,定量磷酸化蛋白质组学因其磷酸化蛋白质所具有的独特特征,在技术和方法研究方面将面临更为严峻的挑战.综述了磷酸化蛋白质组学定量的一些分析技术和方法的发展现状、优缺点以及未来的发展趋势.

液相色谱-质谱联用方法用于严重急性呼吸系统综合症冠状病毒结构蛋白质的研究

通过高效液相反相色谱、毛细管反相色谱 -串联质谱联用方法对SARS病毒攻击细胞的研究 ,鉴定出了N、S和M 3种SARS结构蛋白质 ,并准确测定了N蛋白质的分子量。由分子量结果和生物信息学推断的N蛋白质的理论分子量比较 ,可以确定N蛋白质不存在常见的磷酸化修饰和糖基化修饰或含量很低。进一步的研究表明 :N蛋白质可能存在降解现象 ,其降解机理尚需探索。另外 ,通过对样品直接酶切后进行两维毛细管分离和串联质谱鉴定与对样品先进行分离 ,然后再进行毛细管反相分离 串联质谱鉴定方法比较 ,表明两种方法在蛋白质组学研究中各具优缺点 。

毛细管区带电泳监测牛胰岛素的去折叠过程

用毛细管区带电泳监测了二硫苏糖醇作用下二硫键还原引起的牛胰岛素去折叠全过程 ,同时用离线的基质辅助激光解吸 /电离飞行时间质谱配合确证。从毛细管电泳谱图能直接观察胰岛素去折叠过程中发生的变化 ,获得蛋白质去折叠信息。结果表明 ,毛细管区带电泳作为监测蛋白质构象变化的一种有效手段 ,方法简便、快速、灵敏度高。

基于强阳离子交换色谱分离的磷酸化肽段富集策略

为了在短时间内获得相对含量高的磷酸化肽段,以标准磷酸化蛋白质为模型对强阳离子交换色谱(SCX)分离磷酸化肽段体系的缓冲溶液和梯度设置进行了研究,并用酵母酶切肽段混合物考察了该路线在较复杂的样品中的应用。实验结果表明优化后的体系能够在30min内分离出磷酸肽段,而且非磷酸化肽段的干扰很少,这样便相对提高了磷酸化肽段在质谱仪中的响应强度,重要的是该体系可以对复杂样品进行很好的分离。这说明SCX用于规模化磷酸化肽段富集的策略是可行的。本研究为磷酸化蛋白质组学规模化分析提供了实用技术。

等电聚焦分离与^18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。

Fe_3O_4/TiO_2纳米材料靶上脱盐的基质辅助激光解析/电离质谱新方法研究

建立了一种简便、高效的靶上脱盐新方法。利用Fe3O4/TiO2磁性纳米材料对肽段的吸附作用,将其作为载体用于靶上肽段富集和脱盐。在对纳米材料使用量、浸洗条件进行优化的基础上,成功地鉴定了溶于10mol/L尿素溶液的100fmol的肌红蛋白样品,也对溶于3mol/L尿素溶液中的10fmol的肌红蛋白样品进行了成功地分析鉴定。通过对肌红蛋白样品进行预处理和质谱分析重复实验,表明该方法重现性好,且简便、高效,所需时间短,一次可同时处理多个样品,易于实现通量化,为有效地解决目前蛋白质组分析中所面临的基质辅助激光解析/离子化飞行时间质谱耐盐性差的问题提供了一种新的手段。

麦胚凝集素亲和色谱富集糖肽过程中的肽键裂解

蛋白质的糖基化是最重要的翻译后修饰之一,与蛋白质结构和功能的关系密切。凝集素亲和色谱是蛋白质糖基化研究中很常用的工具,不同的凝集素可以对不同的单糖或寡糖有特异的富集作用。麦胚凝集素(W GA)由于其特异作用的糖型广泛存在而成为使用最多的凝集素之一。在本研究中,发现将W GA用于糖肽亲和富集会导致部分肽段的降解,从而导致后续的肽段序列分析的失败。本文用4种标准蛋白质对这种现象进行了验证,结果表明肽段的降解可以发生在多个位点,其中较多地发生在酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸的羧基端。这一结果提示:在糖蛋白质组研究中,如果应用W GA富集糖肽并采用质谱进行鉴定,则采用半酶切或非特异性酶切的检索策略更为合适。

利用双向电泳比较3种提取户尘螨蛋白的方法

为改进户尘螨过敏原提取方法 ,在采用Coca s液、裂解液及Trizol法提取纯种户尘螨螨体蛋白后 ,用二喹啉甲酸 (BCA)检测法测定蛋白质含量 ,双向电泳比较上述蛋白提取方法的效果。结果显示 ,在蛋白质回收率方面 ,裂解液优于Trizol法优于Coca s液。经过双向电泳 ,Coca s液提取的蛋白仅仅有少量低分子量的蛋白点 ;用裂解液提取的蛋白可见明显增多低分子量的蛋白点 ,但无中分子量的蛋白点 ;Trizol法提取的蛋白可见中分子量的蛋白点如174～ 178ku和 133 0ku的蛋白质。另外 ,纯种户尘螨螨体经Trizol液提取后进行双向电泳 ,在考染和银染时均出现 5个高丰度的特殊蛋白点 ,一个为酸性中分子量蛋白 ,位置孤立的 ;另有 4个位置彼此非常接近的中性蛋白点。比较后结论为使用Coca s液提取的尘螨蛋白质浓度低 ,蛋白点少。使用裂解液提取的尘螨蛋白质浓度虽然较高 ,但是没有中分子量的蛋白点 ,不能全面反映尘螨的过敏原。使用Trizol法提取的蛋白质浓度中等 ,有中分子量蛋白点 ,反映的蛋白点更加全面。纯种户尘螨螨体经Trizol液提取后进行双向电泳 ,在考染和银染时出现的特征性蛋白点 ,作为一种双向电泳的指纹图谱 ,在鉴定此种纯种户尘螨螨体时具有一定的价值。

一种规模化蛋白质组分离和鉴定新方法研究及其应用

建立了一种规模化的蛋白质组分离和鉴定新方法。通过对在生命发育过程中具有重要研究价值的人胎肝线粒体蛋白质组的分离分析,表明与毛细管液-质联用的不同分离方法的组合可以增大检测动态范围和分辨率。研究共鉴定了2977个肽段,归属于915种蛋白质。去除批次间冗余后,鉴定的蛋白质为477种,其中291种为唯一蛋白质,186种为蛋白质簇,144种蛋白质明确定位于人胎肝线粒体中。所鉴定蛋白质的分子量分布范围为7000 Da^330000 Da,pI值分布在4.0~11.89,克服了两维凝胶电泳在分子量和pH方面的歧视性问题。实验中发现的蛋白质簇以及确定一种蛋白质需要最少肽段数的问题还需要进一步研究。

O-GlcNAc修饰蛋白质的生理功能和研究方法

氧连N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)修饰是与磷酸化相类似的蛋白质翻译后修饰方式,它主要发生在细胞核和细胞质中的蛋白质上,与细胞信号通路密切相关,成为近年来的研究热点。该文主要从O-GlcNAc修饰蛋白质的生理功能和研究方法两方面介绍该领域近年来的研究成果。