紫外线对角质细胞线粒体功能及凋亡的影响研究

目的:分析紫外线(UV)照射对HaCaT角质细胞系线粒体功能及凋亡的影响。方法:以紫外线低剂量(UVA2J/cm2,UVB10mJ/cm2)和高剂量(UVA6J/cm2,UVB30mJ/cm2)照射HaCaT细胞,继续培养15 h,用流式细胞仪检测线粒体膜电位(△ψm)、线粒体质量(mitochondrial mass);使用碘化丙啶(PI)进行DNA染色并用流式细胞仪检测亚二倍体分析凋亡,以及进行Annexin V-FITC与PI共染色,用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果:HaCaT细胞经紫外线照射后,△ψm下降的细胞比例随着照射剂量的增加而增加,对照组、低剂量组及高剂量组分别为7.94%±1.02%、25.87%±4.55%、39.27%±5.32%;线粒体质量降低的细胞比例同样随着照射剂量的增加而增加,对照组、低剂量组以及高剂量组分别为15.19%±1.58%、40.36%±4.41%、68.79%±5.46%。用PI检测DNA含量所产生的亚二倍体峰观测凋亡率,对照组、低剂量组以及高剂量组凋亡率分别为1.82%±0.51%、30.16%±5.47%、58.49%±5.98%。用Annexin V-FITC/PI染色分析细胞凋亡程度,其结果与PI-DNA染色所得结果一致,对照组仅有少量细胞死亡,低剂量组凋亡细胞较对照组为多(Annexin V-FITC单阳性细胞),高剂量组以坏死细胞为多(Annexin V-FITC/PI双阳性)。结论:HaCaT细胞经紫外照射后,线粒体去极化作用增强,同时线粒体质量降低,这些变化与细胞凋亡相关。

ERK信号途径对EGF诱导的HaCaT细胞增殖具有双向调节作用

目的利用带有ERK-2基因的腺病毒载体感染成角质细胞系HaCaT,探讨ERK信号途径在EGF对HaCaT细胞增殖影响中的作用。方法用3H-TdR掺入法检测HaCaT细胞增殖及PD98059对EGF促HaCaT细胞增殖的影响。腺病毒载体转染HaCaT细胞,流式细胞仪检测转染率,W estern b lot检测ERK-2蛋白的表达。结果1μg/L和10μg/L EGF可促进HaCaT细胞增殖,而100μg/L EGF促增殖作用反下降。PD98059抑制EGF引起的HaCaT细胞增殖,且具有浓度依赖性。腺病毒载体具有高转染率,感染Ad-ERK2的HaCaT细胞高表达ERK-2。EGF抑制转染的HaCaT细胞增殖。结论ERK信号途径在EGF促HaCaT细胞增殖中具有双向调节作用。

活细胞中丝裂霉素诱导肺腺癌细胞凋亡机理的分析

为了分析丝裂霉素(mitomycin C,MMC)引起的肺腺癌细胞(ASTC-a-1)凋亡,实验通过CCK-8试剂盒检测不同浓度MMC对ASTC-a-1活性的影响,选择10μg/mL的MMC处理ASTC-a-1。利用Hochest 33258染色观察MMC引起的ASTC-a-1凋亡,发现MMC可引起细胞缩小,核浓缩。为了进一步研究MMC引起凋亡的途径,通过脂质体转染pSCAT3质粒,利用光漂白技术和光谱技术观察Caspase-3是否活化;通过转染Bax和Ds-Red质粒观察Bax在凋亡过程中的位置变化及与线粒体的关系。结果显示:MMC可以诱导ASTC-a-1细胞内Caspase-3活化,并使Bax向线粒体转移聚集。在活细胞中证实Caspase-3和Bax参与了MMC引起的ASTC-a-1凋亡。

消癌平诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞内caspase-3活化的荧光光谱分析

采用CCK-8技术检测发现传统中药消癌平(XAP)对人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的增殖活性具有显著的抑制作用。利用共聚焦扫描荧光显微成像、荧光共振能量转移(FRET)及其受体光漂白技术证实了基于FRET技术构建的SCAT3质粒在ASTC-a-1细胞中的稳定表达。将消癌平加入细胞培养液中培育细胞,并在不同的时间检测活细胞内SCAT3的荧光发射光谱,从而监测细胞中caspase-3的活化状态。实验结果表明:(1)消癌平可以有效抑制人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的增殖活性并诱导细胞的死亡,消癌平对细胞的抑制作用具有剂量依赖性。(2)消癌平处理细胞72 h后,细胞内大量的SCAT3被切割,表明细胞内caspase-3的活化水平明显升高。(3)将含消癌平的细胞培养液与细胞共同培养24 h,然后采用没有消癌平的细胞培养液培养细胞48和72 h后,细胞内SCAT3的光谱没有明显改变,表明消癌平作用细胞24 h内没有显著激活细胞内的caspase-3。

Caspase-3参与调控蟾酥诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的凋亡

采用基因质粒转染技术、荧光发射谱检测分析以及荧光共振能量转移(FRET)受体光漂白技术,首次在活细胞中实时检测中药蟾酥(Chan-Su,CS或bufonis venenum)诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞凋亡过程中caspase-3的活化特性.采用CCK-8(Cell Couneing Kit-8)技术检测发现,蟾酥对细胞的活性具有显著的抑制作用;蟾酥处理稳定表达FRET质粒SCAT3的人肺腺癌细胞后,在不同的时间检测活细胞中SCAT3的荧光光谱;利用共聚焦扫描荧光显微成像技术检测蟾酥处理后细胞的形态,从而进一步证实蟾酥诱导细胞凋亡.实验结果表明:a.蟾酥可以有效抑制人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的增殖活性并诱导细胞的死亡.蟾酥对细胞的抑制作用具有剂量依赖性;b.蟾酥处理细胞6h后能检测到明显的细胞凋亡小体,连续作用24h后细胞全部皱褶,并有部分细胞破碎;c.蟾酥作用细胞2h就能明显切割细胞内的SCAT3,细胞内SCAT3的切割程度随着蟾酥作用时间的延长而增加,24h内细胞内的SCAT3完全被切割.受体光漂白实验也证实了该结论,表明caspase-3参与调控了蟾酥诱导的细胞凋亡过程.

紫杉醇诱导不依赖于Caspase-3细胞类似Paraptosis的荧光光谱分析

研究了紫杉醇(Taxol)诱导人肺腺癌细胞(ASTC-a-1)类似Paraptosis的特征和机理。采用CCK-8技术检测了抑制细胞活性的特性,结果表明大于70μmol.L-1浓度的紫杉醇可以显著抑制细胞活性;采用激光共聚焦扫描荧光成像从形态上检测了紫杉醇诱导细胞死亡的形态特征,表明紫杉醇诱导了类似副凋亡(Paraptosis)特征的细胞肿胀和细胞质空泡化,而且没有细胞膜皱褶、细胞核浓缩等细胞凋亡的特征;通过基因质粒转染在细胞转染稳定表达基于荧光共振能量转移(FRET)质粒SCAT3,并利用FRET受体光漂白技术和荧光光谱检测分析技术研究了紫杉醇诱导细胞类似Paraptosis过程中Caspase-3的活化特性,结果表明在紫杉醇诱导细胞质肿胀和细胞死亡的过程中Caspase-3没有被活化。以上研究结果表明紫杉醇可以通过类似Paraptosis的方式明显诱导细胞程序性死亡,该过程不依赖于Caspase-3的活性。

荧光共振能量转移技术对肺腺癌活细胞中消癌平诱导半胱氨酸天冬氨酸酶3活化过程的实时监测(英文)

背景:将生物学技术和光学技术结合起来研究细胞增殖和凋亡的分子机制已成为生物工程学领域的研究热点。目的:应用共聚焦荧光显微成像技术和荧光共振能量转移技术在活细胞中观察消癌平诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。设计:观察对比实验。单位:华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室暨激光生命科学研究所。材料:实验于2006-10/2007-03在华南师范大学激光生命科学重点实验室暨激光生命科学研究所进行。人类肺腺癌细胞为本实验室培养。消癌平注射液为通化神源药业有限公司生产(国药准字Z20025869),G418购自华美生物公司。质粒SCAT3由Miura教授提供,酶标仪(infinite M200,Tecan,Austria),线粒体定位荧光探针购于Molecular Probe公司。方法:①利用细胞计数试剂盒技术检测不同剂量的消癌平对人类肺腺癌细胞活性的抑制作用。②利用共聚焦荧光显微成像技术和荧光共振能量转移技术在大半个活细胞中实时检测消癌平诱导半胱氨酸天冬氨酸酶3活化的动态过程。③利用荧光检测技术在活细胞中检测消癌平作用后不同时间点的SCAT3的荧光发射谱。主要观察指标:①消癌平作用细胞后检测细胞的活性。②消癌平作用后实时检测SCAT3荧光共振能量转移效率的动态变化。③消癌平作用后线粒体形态的动态变化。结果:①消癌平剂量依赖性抑制肿瘤细胞的活性。②消癌平诱导细胞内半胱氨酸天冬氨酸酶3的活化。③消癌平诱导细胞中线粒体变圆和破裂。结论:消癌平可以诱导人类肺腺癌细胞的凋亡,半胱氨酸天冬氨酸酶3参与了其调控过程。

桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响

目的:研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、增殖和细胞周期的影响。方法:以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞,再以不同终浓度的morin与T细胞共培养,利用流式细胞术(FCM),检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达,以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDA-SE)染色检测T细胞的增殖;以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果:小鼠T细胞培养6 h后,未经ConA刺激的对照组中CD69+T的细胞比率为(2.97±0.12)%,经ConA刺激的CD69+T细胞的比率明显增高,达到(72.52±0.66)%,与对照组相比差别明显(P<0.01)。终浓度为25、50、100μmol/L的morin均下调CD69+T细胞的比率,其中,100μmol/L的morin抑制作用最强,为(48.95±0.81)%,与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。CFDA-SE染色分析显示,ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数(PI)分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02),各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖,具有明显地抑制作用,以100μmol/L的morin抑制作用最明显。培养48 h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01),与相应时间的对照组比较,均有统计学意义(P<0.01)。PI染色后流式细胞术分析的结果表明,ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%,显著高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。结论:Morin可显著抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖;其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。

腺病毒介导细胞外信号调节激酶2表达对去分化软骨细胞增殖及胞外基质合成的影响

目的:观察腺病毒介导细胞外信号调节激酶2的过度表达对去分化软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响,以及腺病毒介导细胞外信号调节激酶2用于修饰去分化软骨细胞的可行性。方法:实验于2004-09/2005-05在暨南大学组织移植与免疫研究中心进行。SD大鼠5只,周龄为3～5周,此处请核对体质量为(150±20)g,分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞,利用Adeasy系统构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体。流式细胞仪检测不同感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率,Westernblot检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达,3H-TdR,3H-proline和35S-sulfate同位素掺入检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染对大鼠肋生长板软骨细胞增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响。结果:①成功构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体重组腺病毒。②100感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率大于90%。③携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染的第5代大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1/2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达均显著增加,分别是Ad-CMV组的15.58和1.85倍。④同位素检测结果表明携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体的感染促进3H-TdR、3H-proline和35S-sulfate的掺入,分别是对照组的2.52,1.61和1.53倍(P<0.05)。结论:腺病毒介导细胞外信号调节激酶2基因的过度表达促进去分化大鼠肋生长板软骨细胞的增殖和细胞外基质成分的合成。

腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达

目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达。方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Col.i B J5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MO I)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,W estern b lot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达。结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MO I 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加。结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达。

消癌平诱导caspase-3活化动态过程的实时监测

消癌平是从萝摩科(Asclepiadaceae)植物通关藤(Marsdenia tenacissima)根部提取的药物,已经广泛应用于癌症和多种炎症的临床治疗,并且具有较好的疗效。将消癌平注射液与细胞培养液按照1∶1的比例混合后共同培养人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞,通过CCK-8方法检测发现消癌平能够显著抑制细胞的增长。然后利用荧光共聚焦扫描显微镜和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术在稳定表达了SCAT3质粒的单个ASTC-a-1细胞中实时动态监测消癌平处理后SCAT3的空间分布以及SCAT3被caspase-3切割的动态过程。实验结果表明:消癌平处理后20 min中SCAT3开始向细胞核以及细胞膜部位转移,约在100min左右SCAT3被迅速切割。

沃尔沃挖掘机整机电控系统分析

当前沃尔沃挖掘机应用非常广泛,加强沃尔沃挖掘机整机电控系统的研究,了解沃尔沃整机电控系统的具体功能和实现途径具有非常重要的意义。本文重点对沃尔沃挖机电子控制单元的协调控制技术进行分析,了解各阶段操作装置液压泵和发动机之间的电子控制集系统,以便更好地对沃尔沃挖掘机整机电控系统进行了解,以供参考。

紫杉醇诱导ASTC-a-1细胞的程序性死亡机制研究

利用质粒转染技术和显微荧光成像技术在活细胞中研究了紫杉醇诱导人肺腺癌细胞(ASTC-a-1)的程序性细胞死亡(PCD)过程,利用基因荧光探针分别标记细胞以及细胞的内质网。实验结果表明紫杉醇诱导的细胞质肿胀主要是由于内质网的肿胀引起的;利用rhodamine123标记细胞内的线粒体,研究了紫杉醇对线粒体大小的影响,结果表明紫杉醇诱导了线粒体的肿胀;caspases广谱抑制剂z-VAD-fmk对紫杉醇诱导的细胞肿胀没有影响,表明caspases并没有参与紫杉醇诱导细胞质肿胀的调控过程;Hoechst33258和PI染色实验结果表明紫杉醇没有引起细胞核的浓缩和DNA的断裂以及细胞膜的破裂。以上研究结果进一步确认紫杉醇诱导ASTC-a-1的PCD过程类似paraptosis方式,既不是传统的凋亡方式,也不是坏死方式。