基于哺乳动物细胞系的重组乙酰胆碱酯酶表达载体构建研究

目的 构建具有不同信号肽、载体骨架元件以及乙酰胆碱酯酶编码基因序列的真核表达载体,为基于哺乳动物细胞系表达重组乙酰胆碱酯酶提供前期研究基础。方法 通过NCBI数据库查询苍蝇头部、电鳗鱼电器官来源的乙酰胆碱酯酶基因序列(mdAChE和eleelAChE),经密码子优化后,选择Humaninsulin、小鼠重链、Human CD33 3种信号肽序列,将其与合成的上述目的基因连接后分别与pCMV3、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.4 3种载体骨架元件进行组合,构建重组乙酰胆碱酯酶的表达载体,随后分别在CHO-S、Expi293F细胞系进行瞬时转染表达,产物采用镍柱亲和纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)与蛋白免疫印迹(Western blot)分析鉴定。结果 经菌液聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)及DNA测序鉴定,成功构建了4种重组mdAChE酶的表达载体以及3种重组eleelAChE酶的表达载体。SDS-PAGE、Western blot的结果表明,基于pcDNA3.1(+)和pcDNA3.4载体骨架元件的重组表达载体可实现重组mdAChE和eleelAChE酶的可溶性表达;以p CMV3为载体骨架元件的表达载体,仅在以Human CD33为信号肽时,能在CHO-S细胞系中实现重组mdAChE酶的可溶性表达,其余情况下均未见有效表达。结论 实现了昆虫、鱼类来源的重组乙酰胆碱酯酶在哺乳动物细胞系的可溶性表达,发现载体骨架元件、信号肽类型对其重组表达具有重要影响, CHO-S以及Expi293F细胞均适合重组乙酰胆碱酯酶的表达,后续还需对影响其酶活、农药敏感性的关键限制性因素开展深入研究。

赭曲霉毒素A单克隆抗体的体外制备及其重组抗体的构建研究

目的实现抗赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)单克隆抗体的体外制备及其重组抗体表达载体的构建与瞬时转染表达。方法以前期获得的OTA杂交瘤细胞株(O16)为研究对象,通过无血清驯化培养的方式开展OTA单克隆抗体的体外制备研究;采用简并引物法获取OTA杂交瘤细胞的单克隆抗体编码基因,在此基础上构建OTA重组全长抗体表达载体以及OTA重、轻链可变区基因片段与人源恒定区片段连接的重组嵌合抗体表达载体,并基于哺乳动物细胞系,开展两种重组抗体的瞬时转染表达研究。结果通过缓降血清浓度的方式对OTA杂交瘤细胞进行无血清驯化,实现了体外培养制备OTA单克隆抗体;在此基础上测得OTA单克隆抗体的重链和轻链基因序列,并成功构建了OTA重组全长抗体表达载体(pCDNA3.4-OTA-H/L)和重组嵌合抗体表达载体(p FUSE-OTA-H/L),通过共转染实现了两者在哺乳动物细胞系中的瞬时转染表达;经间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)确定体外培养制备的OTA抗体、OTA重组全长抗体和嵌合抗体均具备特异性结合抗原的能力,三者的线性检测范围分别为1.043~1.671、0.944~1.245、1.387~1.902 ng/mL,均保留了对OTA的特异性结合能力。结论通过缓降血清的方式得到了适应无血清培养的OTA杂交瘤细胞,进而实现了体外培养制备OTA单克隆抗体;成功构建了OTA全长重组抗体及人源嵌合抗体的表达载体,并在哺乳动物细胞中实现了其重组抗体的瞬时转染表达。