猪瘟病毒基因2型流行毒株和疫苗C株抗血清与相应E2蛋白交叉免疫反应性分析

为研究猪瘟病毒(CSFV)2.1基因亚型病毒株和疫苗C株E2蛋白与相应抗血清的免疫反应性差异,本研究在分析4株CSFV浙江流行株(QZ-14、JH-14、QZ-07和HZ-08)与疫苗C株E2变异程度的基础上,制备了流行病毒株和疫苗C株全病毒猪抗血清以及针对流行株E2的单克隆抗体(MAb)4F4,比较了它们与同源株和异源株重组杆状病毒表达的E2蛋白的亲和性。结果显示,4株浙江分离株中2株(QZ-14和JH-14)属于亚型2.1d,另2株(QZ-07和HZ-08)为亚型2.1b,它们与C株E2的核苷酸同源性在82%~84%;间接免疫荧光鉴定显示MAb 4F4能够识别4株流行株,但不与C株反应;接种流行株的动物均出现不同程度临床症状;ELISA分析显示疫苗C株血清与流行株E2蛋白的反应性约为C株E2蛋白的27%~49%,2株流行株感染血清与C株E2蛋白反应性约为流行株E2蛋白的34%~50%,免疫印迹分析显示类似结果。以上结果表明CSFV基因2型流行株与疫苗C株E2蛋白的差异显著影响其与相应抗血清的交叉免疫反应性,这一现象是否与C株猪瘟疫苗免疫保护效果下降有关还有待于进一步研究。

猪瘟弱毒标记疫苗候选株RecC-M1对猪的安全性研究

为探究猪瘟弱毒标记疫苗候选株RecC-M1(将牛病毒性腹泻病毒1型E^(rns)和猪瘟病毒基因2型流行株E2高变区分别置换弱毒疫苗C株对应区域构建而成)对猪的安全性,本实验以2.0×10^(5)FAID_(50)(50%荧光抗体感染剂量)高剂量的RecC-M1株经颈部肌肉注射接种12头35日龄猪瘟病毒(CSFV)抗体阴性仔猪,另设生理盐水对照组6头。接种后观察各组猪的临床症状,并于接种后不同时间(0、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、28 d和42 d)采血用于细胞计数;接种后7 d和42 d各取6头猪(包括第42 d对照组6头猪),剖杀后观察各组织剖检病变,并取各组织制作切片观察组织病变,采用qPCR检测病毒在各组猪各组织中的分布。根据qPCR结果,选择阳性组织样品(扁桃体、肾脏和淋巴结)的病理切片采用免疫组化法检测RecC-M1株在猪上述各组织中的分布。于接种后0~7 d、14 d、28 d和42 d分别采集各组猪的鼻拭子和肛拭子样品以及不同时间采集的血液,均采用qPCR检测各组猪的病毒血症及排毒;采用间接ELISA分别检测各组猪血清中分别针对BVDV及CSFV相应抗原的抗体水平。结果显示,RecC-M1组猪在42 d的观察期内均未出现临床症状,体温、白细胞数和淋巴细胞数与阴性对照组猪均无明显差异,且均在正常范围内;剖检及组织病变观察结果显示,接种后7 d和42 d猪的各组织均未见淤血或出血;扁桃体、淋巴结、脾、肾、膀胱、回盲瓣等CSFV嗜性组织均未见明显的病理学变化;各组织样品的qPCR结果显示,接种后7 d所有6头猪的肾脏和扁桃体样品和2头猪的淋巴结样品中均检出CSFV核酸,而接种后42 d所有猪的组织样品均为阴性;免疫组化结果显示,接种后7 d猪扁桃体和肾脏样品中CSFV抗原均呈阳性,接种后42 d猪的所有组织样品则均转为阴性;病毒血症和排毒的qPCR结果显示,接种后14 d内部分猪血液、鼻拭子和肛拭子样品中检出CSFV核酸,接种后28 d和42 d所有猪血液、鼻拭子和肛拭子则均为阴性。间接ELISA结果显示,接种后14 d针对BVDV1 E^(rns)抗体开始上升,而针对CSFV E2的抗体则在接种后7 d开始上升,此后两种抗体水平均随时间的推移呈持续上升趋势。阴性对照组猪各组织均未见明显剖检及组织病变,各组织CSFV抗原,各组织、血液及拭子样品均为阴性,也未产生针对相应病毒抗原的抗体。上述结果表明,高剂量的RecC-M1株对猪是安全的,本研究为RecC-M1株作为猪瘟弱毒标记疫苗的产业化开发奠定实验基础。

基于量子点标记的赭曲霉毒素A快速、高灵敏荧光免疫层析检测方法的建立及应用

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)具有肾毒性、致畸性、致癌性和免疫毒性,广泛存在于各种粮食作物及其副产品中,是食品和饲料原料的重要污染物,可在人类及动物体内蓄积,在已知发现的真菌毒素中,重要性和危害性仅次于黄曲霉毒素。本研究通过采用量子点荧光微球(quantum dots,QDs)标记OTA单克隆抗体,并基于免疫层析原理,优化、建立了OTA高灵敏荧光免疫层析检测方法(FICGA),15min即可实现对农产品中OTA污染的快速定量检测。该方法检测下限(IC10)达到0.04ng/mL,检测区间(IC20-IC80)为0.05–0.59ng/mL,半数抑制率(IC50)为0.18ng/mL。与OTA类似物OTB、OTC交叉反应性为7.3%和11.9%,对其他常见真菌毒素AFB1、ZEN、FB1和DON均无交叉反应。在玉米、面粉和大豆样本中的加标回收率可达83.2%–117.8%,与LC-MS/MS同时对天然样本中OTA含量的检测结果表明,两种方法相关性良好。本研究建立的FICGA快速、灵敏,可满足基层单位和现场的快速检测需求,具有很好的应用前景。