二乙基亚硝胺诱导肝细胞癌模型鼠肠道微生态研究

目的:探索肝细胞癌模型鼠肠道微生态特征。方法:将2周龄C57BL/6雄鼠分为正常对照组和肝癌模型组。肝癌模型组在出生后2周给予单次腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN),其中存活小鼠自4周龄起腹腔注射1,4-双[2-(3,5-二氯吡啶氧)]苯,每2周一次,共8次。分别于小鼠出生后第10、18和32周随机处死部分实验动物,取肝脏进行组织病理学检查。其中,在小鼠出生后第32周处死动物前无菌条件下收集两组粪便标本,并进行V3~V4高可变区16S rRNA基因组测序,进而对菌群多样性、物种丰度差异、菌群相关性、表型预测以及功能预测进行分析。结果:α多样性分析结果显示Good’s coverage均已达到最大值1.00,且正常对照组与肝癌模型组肠道菌群Observed features、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数差异均有统计学意义(均P<0.05)。β多样性分析结果显示基于加权或未加权Unifrac距离的主坐标PCoA均R>0,标本的组内差异小于组间差异;两组标本的分离趋势明显(P<0.05)。拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门及髌骨菌门等菌群为正常对照组与肝癌模型组门水平的优势菌群,但肝癌模型组较正常对照组拟杆菌门丰度显著减少(P<0.01),而髌骨菌门丰度显著增加(P<0.05)。正常对照组属水平的优势菌群主要为鼠杆菌科未分类属、副鼠杆菌属、鼠杆菌属、毛螺旋菌科NK4A136属、欧陆森氏菌属等,而肝癌模型组为艾克曼菌属、杜氏杆菌属、鼠杆菌科未分类属、毛螺旋菌科NK4A136属、红椿杆菌科UCG-002属等。两组属水平菌群相对丰度差异有统计学意义的有30个菌属(均P<0.05)。两组小鼠肠道菌群LEfSe分析共发现14个多级别差异物种(均P<0.05,LDA评分超过4.0),主要富集在拟杆菌门。其中正常对照组为拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、鼠杆菌科等10个差异菌群富集,肝癌模型组为杜氏杆菌属、消化链球菌属等4个差异菌群富集。正常对照组肠道优势菌属之间既有正相关关系又有负相关关系(|rho|>0.5,P<0.05),肝癌模型组肠道优势菌属的相关性网络复杂程度比正常对照组降低,所有优势菌群的相互作用均呈较强的正相关。与正常对照组比较,肝癌模型组肠道菌群革兰阳性菌及移动元件菌基因相对丰度均显著上调(均P<0.05),而革兰阴性菌(P<0.05)及潜在致病性菌基因(P<0.05)相对丰度均显著下调。两组肠道菌群的基因代谢通路差异显著,其中正常对照组富集在能量代谢、细胞分裂及核苷酸代谢等18个代谢通路,而肝癌模型组富集在能量代谢、氨基酸代谢及碳水化合物代谢等12个代谢通路(均P<0.005)。结论:DEN诱导原发性肝癌模型小鼠肠道菌群数减少,菌群构成、菌群相关性、表型和功能均发生改变,其中门水平的拟杆菌门以及属水平的鼠杆菌科未分类属、鼠杆菌属、消化链球菌属、杜氏杆菌属等菌群可能与DEN诱导肝细胞癌的发生有关。