健脾化瘀方调控TGF-β1/Smad7通路逆转肝细胞癌上皮间质转化及血管生成

目的探讨健脾化瘀方(人参、茯苓、白术、丹参等)通过TGF-β1/Smad7通路对肝细胞癌上皮间质转化(EMT)及血管生成的调控作用。方法(1)采用BALB/C-nu裸鼠建立Hep3B荷瘤小鼠模型,随机分为对照组及健脾化瘀方低、中、高剂量组(3.844、7.689、15.378 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组5只。灌胃给药,每日1次,连续给药21 d。(2)将Hep3B细胞分为空白组、造模组(10 ng·mL^(-1)TGF-β1)、低浓度组(10 ng·mL^(-1)TGF-β1+4 mg·mL^(-1)健脾化瘀方)、高浓度组(10 ng·mL^(-1)TGF-β1+6 mg·mL^(-1)健脾化瘀方),TGF-β1诱导48 h后更换为相应浓度的健脾化瘀方完全培养液(0、4、6 mg·mL^(-1))继续培养24 h。(3)将HUVEC细胞分为正常组、模型组、中药组、模型加中药组。正常组细胞用不含TGF-β1的条件培养基培养;模型组细胞用含TGF-β1的条件培养基培养;中药组细胞用含有4 mg·mL^(-1)健脾化瘀方但不含TGF-β1的条件培养基培养;模型加中药组细胞用含4 mg·mL^(-1)健脾化瘀方且含TGF-β1的条件培养基培养。继续培养24 h后收集细胞进行后续实验。(4)计算Hep3B荷瘤裸鼠皮下移植瘤的瘤质量指数和抑瘤率;采用免疫荧光法检测荷瘤裸鼠皮下移植瘤中CD31的表达;免疫组化法检测荷瘤裸鼠皮下移植瘤的微血管密度;细胞划痕实验检测Hep3B细胞的迁移能力;Transwell实验检测Hep3B/HUVEC细胞的侵袭能力;检测HUVEC细胞小管形成能力;Western Blot法检测荷瘤裸鼠皮下移植瘤、Hep3B及HUVEC细胞中相关蛋白的表达水平。结果(1)与对照组比较,健脾化瘀方中、高剂量组荷瘤裸鼠皮下移植瘤质量及瘤质量指数显著降低(P<0.01);低、中、高剂量组荷瘤裸鼠皮下移植瘤中CD31的表达量及微血管密度显著降低(P<0.05,P<0.01),VE-cadherin、EphA2、N-cadherin蛋白表达显著下调(P<0.05,P<0.01),E-cadherin、Smad7蛋白表达显著上调(P<0.01)。(2)与空白组比较,造模组的Hep3B细胞的相对迁移率明显升高(P<0.05),侵袭细胞数显著增加(P<0.01);Vimentin、N-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.01),E-cadherin、Smad7蛋白表达显著下调(P<0.01)。与造模组比较,健脾化瘀方低、高浓度组Hep3B细胞的相对迁移率显著降低(P<0.01),侵袭细胞数显著减少(P<0.01);Vimentin、N-cadherin蛋白表达显著下调(P<0.01),E-cadherin、Smad7蛋白表达显著上调(P<0.01)。(3)与正常组比较,模型组HUVEC细胞形成的小管分支点数显著增多(P<0.01),小管分支长度及侵袭细胞数显著增加(P<0.01);VE-cadherin、EphA2蛋白表达显著上调(P<0.01),Smad7蛋白表达显著下调(P<0.01)。与模型组比较,模型加中药组HUVEC细胞形成的小管分支点数显著减少(P<0.01),小管分支长度显著缩短(P<0.01),侵袭细胞数显著减少(P<0.01);VE-cadherin、EphA2蛋白表达显著下调(P<0.01),Smad7蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论健脾化瘀方可明显抑制肝细胞癌的生长、侵袭与迁移,可能与通过调控TGF-β1/Smad7通路介导的EMT及血管生成有关。

莪术醇通过PTEN/PI3K/AKT通路调控肝癌细胞自噬和上皮间质转化的机制

目的:探讨莪术醇对肝癌细胞自噬和上皮间质转化的的调控机制。方法:采用CCK-8、Transwell和划痕实验检测莪术醇对HepG2细胞增殖、侵袭及迁移的影响。Western Blot检测不同浓度莪术醇对磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3肌酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)通路、上皮间质转化和自噬相关蛋白的影响。加入Rapa或3-MA后,单丹磺酰尸胺(MDC)染色法检测自噬囊泡的聚集情况,Western Blot检测上皮间质转化和自噬相关蛋白的表达水平,划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果:莪术醇以时间、剂量依赖的方式抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移。莪术醇干预后,PI3K、p-AKT蛋白水平下降(P<0.01)、PTEN蛋白水平升高(P<0.01);Vimentin蛋白下调(P<0.01)、E-cadherin蛋白上调(P<0.01);LC3-Ⅱ蛋白上调、P62蛋白下调。3-MA能够逆转莪术醇对HepG2细胞的抑制效应。结论:莪术醇可显著抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能是调控PTEN/PI3K/AKT通路介导的细胞自噬和上皮间质转化。

健脾化瘀方对TGF-β1诱导的肝癌细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响

目的:探讨健脾化瘀方对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肝癌细胞MHCC-97H上皮间质转化(EMT)及侵袭转移能力的影响。方法:将不同浓度(0.5、1、2、4、8μmol/L)的健脾化瘀方作用于肝癌细胞MHCC-97H,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法评估细胞活力;TGF-β1诱导肝癌细胞建立EMT模型,倒置显微镜观察细胞形态的变化;根据加入不同浓度健脾化瘀方干预,将实验分为空白组、EMT组、EMT+健脾化瘀方2 mg/mL组(低浓度组)、EMT+健脾化瘀方4 mg/mL组(高浓度组);划痕法和Transwell实验检测肝癌细胞侵袭/迁移能力;Western Blot法检测EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。结果:健脾化瘀方能抑制肝癌细胞MHCC-97H的增殖,并呈一定的时间-剂量依赖关系(P<0.01)。显微镜下观察经过TGF-β1诱导后的肝癌细胞形态松散,呈梭形样改变。与空白组比较,EMT组的迁移/侵袭能力显著增强(P<0.01),给予药物干预后,高、低浓度组的迁移/侵袭能力较EMT组显著减弱(P<0.01)。与空白组比较,EMT组细胞中的E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著升高(P<0.01);高、低浓度组E-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.01),而N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论:健脾化瘀方能抑制TGF-β1诱导的肝癌细胞MHCC-97H的迁移/侵袭能力,其机制可能与抑制上皮间质转化有关。

健脾化瘀方调控circβ-catenin/Wnt通路介导肝癌细胞上皮间质转化的机制

目的:探讨健脾化瘀方抑制肝癌细胞增殖和侵袭的作用及机制。方法:制备健脾化瘀方冻干粉,干预人肝癌HepG2细胞后,CCK-8试剂检测细胞活力,划痕实验检测细胞的迁移能力,Transwell实验检测细胞的侵袭能力。qPCR检测circβ-catenin mRNA表达水平的变化,Western Blot检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达。免疫荧光检测细胞β-catenin、N-cadherin的表达情况。结果:健脾化瘀方抑制肝癌HepG2细胞的增殖,随着药物浓度的升高,细胞活力显著降低。与空载质粒(p-vector)组比较,转染circβ-catenin质粒后,细胞迁移能力和侵袭能力显著提高(P<0.01),circβ-catenin mRNA表达水平显著升高(P<0.01),Wnt2、β-catenin、Vimentin、N-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05,P<0.01),E-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与p-vector组或circβ-catenin-OE组比较,健脾化瘀方干预后,抑制肝癌细胞发生EMT,下调Wnt2、β-catenin、Vimentin、N-cadherin蛋白水平(P<0.05,P<0.01),上调E-cadherin蛋白水平(P<0.01)。结论:健脾化瘀方能够抑制HepG2细胞的增殖及侵袭,其机制可能是通过调节circβ-catenin/Wnt通路介导EMT发挥作用。