广东一株猪伪狂犬病毒野毒的分离鉴定和致病性初步研究

为了证实广东阳江某猪场存在猪伪狂犬病毒(PRV)强毒力野毒感染,试验采用病毒分离鉴定及仔猪攻毒试验的方法,对该猪场保育猪群病料中存在的病毒进行分离鉴定,以及用15日龄含有母源抗体(中和效价水平为1∶16)的仔猪进行毒株致病性的初步研究。结果表明:从病料中成功分离出1株PRV野毒株GD-1406株;经滴鼻攻毒,试验Ⅰ组(病毒攻毒效价为1×106TCID50/m L)仔猪攻毒后第5天全部死亡,试验Ⅱ组(病毒攻毒效价为1×104TCID50/m L)仔猪攻毒后第4天死亡率达80%,第6天全部死亡;病理剖检显示,分离的PRV对试验组仔猪的多种组织器官造成肉眼可见的损伤,对照组正常。说明该猪场保育猪群中有PRV野毒强毒株存在。

一种快速检测猪伪狂犬病毒野毒株的普通PCR方法的优化研究

为了快速、便捷运用普通PCR对猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）野毒株进行检测,试验选取PRV g B、g E基因保守区序列,设计2对特异性引物,通过正交试验设计探索最优水平组合的PCR体系,建立鉴别检测PRV野毒株的普通PCR方法,并验证其特异性、敏感性、重复性、稳定性以及对临床样品的检测效果。结果表明：PCR体系的最优水平组合为Taq Mix 8μL,g B、g E引物的终浓度分别为0.2μmol/L和0.2μmol/L。建立的普通PCR检测体系仅对PRV野毒株呈双阳性,对疫苗株g B基因呈单阳性,检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪乙型脑炎病毒、大肠杆菌等均显示阴性;敏感度介于1×103~1×104TCID50/m L病毒效价之间;重复性与稳定性良好;检测20份广东地区猪场临床疑似样品,疫苗毒株阳性率为25%,野毒株阳性率为10%,g B、g E单项PCR检测的符合率为100%。说明试验优化建立的普通PCR方法能对PRV野毒株进行快速鉴别诊断。

伪狂犬病病毒GD1406变异株的抗原性分析

为了解近年来广东省伪狂犬病病毒(PRV)变异情况,本研究从猪场收集Bartha-K61活疫苗免疫后的猪血清559份,经ELISA筛选出326份gB抗体阳性且gE抗体阴性的猪血清,进行中和试验,分析血清中的疫苗抗体对Bartha-K61株和临床分离到的PRV GD1406野毒株的中和能力。进一步应用小鼠进行交叉免疫保护性试验。结果显示,187份gB阳性且gE阴性的猪血清样品对Bartha-K61株和PRV GD1406野毒株的平均中和抗体滴度分别为1:57和1:13,并且免疫Bartha-K61株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率仅为20%,而免疫PRV GD1406野毒株使小鼠免受Bartha-K61株致死性攻击的保护率为100%,免疫灭活PRV GD1406野毒株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率为40%。根据试验结果推测,PRV GD1406野毒株与Batha-K61株之间存在抗原差异性,现用疫苗不能有效抵抗PRV变异株攻击。本研究结果将为PRV的防控提供实验依据,为研制PRV新疫苗提供新的思路。

全预混冻干PCR试剂检测草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的研究

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型是导致草鱼出血病的主要病原体之一,目前在我国广泛流行。本研究根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型基因序列,设计了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。试验对反转录和PCR反应体系进行摸索,通过优化的冻干工艺制备出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型全预混RT-PCR试剂,在荧光定量PCR中,冻干试剂的检测灵敏度可达10个模板,是普通PCR的100倍。批次间变异系数小于4%。特异性试验结果表明,该方法可特异性地检出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型,而对鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死症病毒无检测信号。该冻干试剂4℃保存12个月,室温25℃保存3个月,37℃保存15d,敏感性仍为10个,与第1d相同;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42min内完成核酸诊断。本试验基于荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的全预混草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型RT-PCR试剂具有耐保存便于运输、准确性高、仪器拓展性好的特点,对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型快速诊断有重要意义。

猪伪狂犬病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及其冻干检测试剂的制备

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染猪引起的一种传染病,目前在我国广泛流行。本研究针对GenBank中PRV的gE基因序列进行比较分析,在其保守区设计了特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了可以区别野毒株和基因缺失疫苗株的TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性地检测出野毒感染,而对基因缺失疫苗株、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒无检测信号;对PRV检测的灵敏度可达10个模板拷贝数,是普通PCR的100倍。通过优化的冻干工艺制备出PRV全预混PCR试剂,室温25℃保存3个月或37℃保存15d,敏感性仍为10个拷贝,推测储存于4℃的有效期约为24个月;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42 min时间内完成核酸诊断。本研究基于TaqMan荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的PRV PCR冻干试剂具有耐保存,便于运输,准确性高等特性,对快速诊断PRV和病毒定量检测具有重要意义。

猪圆环病毒2型Cap蛋白毕赤酵母分泌表达及发酵条件优化

为实现猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白在酵母中的高效表达,本研究将去除信号肽并经序列优化后的PCV2 ORF2片段插入pPICZαA表达载体,将重组表达质粒克隆转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33感受态细胞中,应用Zeocin抗性和PCR法对转化子进行初步筛选和表型鉴定,利用"双膜法"筛选出PCV2 Cap表达量相对较高的酵母。采用正交试验对优选的酵母进行发酵试验,分析培养基pH、甲醇诱导时间、甲醇诱导浓度和诱导时酵母浓度对PCV2重组Cap蛋白(rCap)分泌表达的影响。结果显示酵母分泌表达PCV2 rCap的优化条件为:培养基pH为5.0,发酵液OD600nm至1.0,加入终浓度1.0%甲醇诱导96 h。优化后的PCV2 rCap分泌量可达207.58μg/m L。中和试验结果显示,发酵产物PCV2 rCap免疫小鼠产生的抗体可有效中和PCV2。本研究为利用酵母表达PCV2 Cap进行疫苗研制奠定了基础。

PRV变异株gB和gC基因分子特征及抗原差异性分析

对3株(GD1406、FS2015、FJFZ株)变异伪狂犬病病毒(PRV)的gB和gC全基因进行扩增、测序及生物信息学分析,应用微量交叉中和试验分析抗原差异性。基因序列比对结果显示,3株PRV变异株之间gB、gC基因核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%~100.0%和99.6%~100.0%,100.0%和99.0%~100.0%;gB和gC基因系统进化树遗传进化分析显示:系统进化树分为2大支,其中一个大支为国内经典毒株群、2011年后分离的变异毒株群2个小分支所占据的中国毒株群;另一个大支为欧洲分离株和美洲分离株组成的欧美毒株群。微量交叉中和试验结果显示,PRV-Bartha K61高免血清中和PRV-GD1406和PRV-Bartha K61的效价分别为22和53,PRV-GD1406高免血清中和PRV-GD1406和PRV-Bartha K61的效价分别为37和44;PRV-GD1406毒株异源血清中和效价/同源血清中和效价约为0.83,PRV-Bartha K61毒株异源血清中和效价/同源血清中和效价约为0.59;2个毒株(PRV-GD1406、PRV-Bartha K61)间交叉反应程度相关系数R=0.72。