A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用

目的制备和鉴定A型流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体,建立A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法,用于A型流感病毒感染的实验室早期诊断。方法利用杆状病毒系统表达A型流感病毒核衣壳蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定,用双抗体夹心ELISA捕获法建立检测A型流感病毒核衣壳蛋白的方法。结果获得8株、共识别4个A型流感病毒核衣壳蛋白不同抗原位点的单克隆抗体,选择以单抗2B8A11作为捕获抗体,以C16A15作为检测抗体为最佳抗体对,建立双抗体夹心ELISA捕获法。检测流感患者的当日采集和冻存的呼吸道标本,与病毒分离培养方法的符合率分别为100%和42.9%;与B型流感病毒和其他呼吸道病毒无交叉反应。检测流感患者当日采集的呼吸道标本敏感性高于德国Serion试剂盒(P<0.001),与RT-PCR方法比较差异无显著性(P=0.5)。结论成功建立了灵敏度高、特异性强的A型流感病毒核衣壳蛋白抗原的ELISA捕获法,为A型流感病毒感染的实验室早期诊断提供技术方法。

双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p抗体

目的建立一种检测马尔尼菲青霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达重组马尔尼菲青霉特异性甘露糖蛋白Mp1p,并利用改良过碘酸钠法标记Mp1p,经棋盘滴定法建立一种可检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,并检测100例健康人群对照血清、21例血培养确诊其他真菌感染病人血清和15例血培养确诊马尔尼菲青霉病人血清,联合本实验室前期建立的马尔尼菲青霉抗原检测方法评价其临床应用价值。结果成功建立一种检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,经健康人群对照及其他真菌感染病人血清评价特异度为100%(121/121),检测15例马尔尼菲青霉病人血清,Mp1p特异性抗体2例阳性,Mp1p特异性抗原12例阳性,Mp1p抗体与抗原联合检测可明显提高灵敏度,达到93.3%(14/15)。结论双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体具有高度的特异性,联合抗原检测可提高马尔尼菲青霉感染诊断率。

禽流感病毒血凝素H5特异性单克隆抗体的制备及ELISA捕获法的建立

目的制备和鉴定禽流感病毒（H5N1）血凝素（H5）特异性单克隆抗体（mAb）,建立H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。方法以H5血凝素和携带H5全长基因的质粒免疫Balb/c小鼠制备mAb,利用血凝抑制（HI）实验筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验筛选捕获抗体和检测抗体,建立测定H5抗原的双抗体夹心ELISA捕获法。结果获得16株特异性针对H5的单克隆抗体,与A型流感病毒H1、H3、H7、H9和B型流感病毒的血凝素无HI交叉反应,对H5血凝素的血凝抑制效价为1∶100-1∶51200;通过配对实验,建立以单克隆抗体H5M9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记单克隆抗体H5M11为检测抗体的双抗体夹心ELISA;检测多株H5N1病毒和H5血凝素的最低检出值为1/32血凝单位,检测A型流感病毒H1N1、H3N2、B型流感病毒以及H7、H9血凝素均为阴性。结论建立了一种灵敏度高、特异性强的测定H5抗原的ELISA捕获法,可应用于禽流感病毒H5N1感染的实验室早期诊断。

捕获ELISA法测定抗EV71-IgM抗体用于EV71感染早期诊断

目的探讨捕获ELISA法测定抗肠道病毒71型(EV71)IgM抗体在EV71感染所致手足口病(HFMD)早期诊断中的价值。方法以实时荧光RT-PCR检测89例临床初诊为HFMD患儿的粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子的肠道病毒RNA。用40例排除HFMD的5岁以下儿童血清为抗EV71-IgM抗体阴性对照,以捕获ELISA法检测患儿不同发病期血清中抗EV71-IgM抗体。结果经实时荧光RT-PCR检测,89例HFMD患儿粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子中EV71感染28例,柯萨奇病毒A16(CA16)感染43例,非EV71和CA16的肠道病毒感染14例,非肠道病毒感染4例。EV71感染者发病1～3 d、4～6 d及>6 d的血清抗EV71-IgM抗体阳性率分别为81.3%、100%和100%;CA16感染者分别为10.0%、26.4%和65.7%;非EV71和CA16的肠道病毒感染者及非肠道病毒感染者在发病1～3 d和4～6 d无1例阳性;阴性对照组无1例阳性。抗EV71-IgM抗体在EV71感染的早期(急性期)的诊断敏感性和特异性分别为81.3%和92.9%。结论 EV71感染者与CA16感染者血清抗EV71-IgM抗体在发病4 d后存在较明显的交叉反应。抗EV71-IgM抗体可用作EV71感染早期诊断的血清学标志物。

2665例急性上呼吸道感染患儿的病原学及临床特征

目的分析急性上呼吸道感染儿童患者的病原学及临床特征。方法以南方医科大学珠江医院2009年11月至2015年9月收治的2665例急性上呼吸道感染儿童为研究对象,采用qRT-PCR方法检测临床上常见的8种呼吸道病毒(流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、人类博卡病毒、人类冠状病毒、人类偏肺病毒、鼻病毒)。结果共检测患儿标本2665份,其中阳性标本1566份,总阳性率为58.8%。四个季节中8种呼吸道病毒检出率存在明显差异,并以春季最高,夏冬季次之,秋季最低。儿童呼吸道病毒感染率随着年龄增加而逐渐降低,并以0~1岁婴幼儿病毒检出率最高64.5%。男童呼吸道病毒感染率高于女童,住院患儿呼吸道病毒检出率高于门诊患儿。混合感染标本260份,占阳性标本数的16.6%,主要集中于0~3岁儿童患者标本中,并因季节而异,秋冬季节较少,而春夏季节较为普遍。咳嗽为呼吸道病毒感染的主要临床症状,咳痰和流涕次之,临床症状在8种呼吸道病毒感染患儿中存在差异。结论本调查分析了急性上呼吸道感染患儿中8种常见呼吸道病毒的病原学及临床特征,为指导临床治疗及防控提供相关数据。

B型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用

目的制备和鉴定B型流感病毒核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(mAb),建立双抗体夹心捕获抗原ELISA,用于B型流感病毒感染的早期诊断。方法用重组B型流感病毒N蛋白和B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,采用ELISA间接法、免疫荧光(IFA)和免疫印迹(WB)进行筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验建立双抗体夹心捕获抗原ELISA检测B型流感病毒N抗原。结果获得12株特异性针对B型流感病毒N蛋白的mAb,识别8个不同的抗原位点,根据mAb识别抗原表位,对mAb进行多种组合的配对试验,筛选出2株单抗BN4和BN8混合作为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的单抗BN1和BN5混合作为测定抗体,建立了双抗体夹心ELISA,测定新鲜的漱口液标本的灵敏度达100%,而对冻融的漱口液标本检测灵敏度为83.9%,与其他呼吸道病毒如A型流感病毒、副流感病毒等无交叉反应,特异度达100%。结论获得特异性好的mAb,经过抗体的配对和优化,建立了一种灵敏度高、特异性强的B型流感病毒抗原的ELISA捕捉法,可用于B型流感病毒感染的早期实验室诊断及流行病学研究。

SARS-CoV、229E和OC43的抗原相关性研究

目的:分析SARS冠状病毒(SARSCoV)和人冠状病毒(229E和OC43)的抗原相关性。方法:制备三株冠状病毒的免疫兔血清及其重组核衣壳(N)蛋白的免疫小鼠血清,分别采用ELISA法、Westernblot和免疫荧光法对免疫血清进行检测以分析三株冠状病毒的抗原相关性。结果:Westernblot结果显示重组N蛋白免疫小鼠血清仅与各自的冠状病毒或重组N蛋白有特异性反应,相互间无交叉反应,而ELISA结果显示OC43重组N蛋白免疫小鼠血清与SARSCoV、229EN蛋白出现了构象抗体的交叉反应。同时,免疫荧光结果显示SARSCoV和OC43免疫兔血清与229E感染细胞存在较明显的交叉反应,但在ELISA、Westernblot结果中全病毒免疫兔血清均仅与各自N蛋白特异性反应,相互间无交叉反应。结论:SARSCoV、229E和OC43N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应,而SARSCoV、OC43全病毒免疫血清均和229E出现明显的交叉反应。另外,基因重组的OC43N蛋白与另外二种N蛋白出现重组构形表位的交叉反应,提示以基因重组的蛋白作为诊断试剂,可能会因为蛋白的空间构象发生改变而产生非特异性反应。

一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒

目的探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值。方法以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71。结果64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64)。实时荧光RT-PCR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性。结论实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断。

禽流感病毒H5N1血凝素基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的应用杆状病毒-昆虫细胞表达体系克隆及表达禽流感病毒H5N1血凝素H5抗原,鉴定其抗原性和生物活性。方法PCR扩增禽流感病毒H5全长基因序列,克隆、转化制备重组杆状病毒Bacmid质粒,通过转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达。采用细胞免疫荧光、Westernblotting和血凝试验分别对表达的蛋白进行抗原性和生物活性分析。结果在昆虫细胞中成功表达禽流感病毒重组his-H5蛋白,其相对分子质量约为64000,与豚鼠红细胞能够发生凝集反应,免疫荧光与Westernblotting结果提示该重组蛋白能够与禽流感病毒H5标准血清中的抗体特异性结合。结论经杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得的重组his-H5抗原具备天然的生物活性和抗原性,该方法为进一步研究禽流感病毒血凝素抗原生物学特性以及制备亚单位疫苗、相关抗体奠定了基础。

RVPFast与实时荧光PCR/RT-PCR检测呼吸道病毒结果的比较

目的评价xTAG呼吸道病毒群快速检测(Respiratory Virus Panel Fast Array,RVP Fast)技术检测呼吸道病毒的临床应用价值。方法选取经实时荧光定量PCR/RT-PCR筛查的74份呼吸道病毒阳性和4份阴性鼻拭子标本,用RVP Fast和RTPCR同时检测78份标本的8种呼吸道病毒及其亚型(共19型),运用McNemarχ2检验,Kappa检验和线性回归方法对检测结果进行统计处理。结果两种方法检测78份标本有71份结果完全相符,包括55份单个病毒感染标本,12份混合病毒感染标本和4份阴性标本。两种方法检测结果总体比较无统计学差异(P>0.05),一致性较好(Kappa=0.960,P<0.01),RVP Fast荧光强度中位数(MFI)与实时荧光PCR/RT-PCR阈值循环数(Ct)呈负相关(r=-0.529,P<0.01)。结论 RVP Fast芯片技术的检测性能准确可靠,可应用于国内呼吸道病毒感染的快速、高通量检测,具有推广价值。

禽流感病毒非结构蛋白1单克隆抗体的制备及其特异性分析

为研制禽流感病毒(H5N1)非结构蛋白1(NS1)的特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性,本研究在分别表达了具有良好抗原性的A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白基础上,用A/Viet-nam/1194/04(H5N1)-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光和免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制实验对单抗识别的抗原位点进行分析。结果共获得19株能识别4个H5N1-NS1蛋白不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,5株为IgG2a、1株为IgG2b,另外13株为IgG1。这些mAb均与A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白特异性结合,免疫荧光检测均与A型流感病毒(H1N1和H3N2)有交叉反应,而与B型流感病毒无交叉现象。表明成功获得特异性针对H5N1-NS1蛋白的mAb,为进一步研究禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能奠定基础。

人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体的制备及3株人冠状病毒N蛋白的抗原相关性观察

目的通过制备和鉴定人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(mAb),观察3株人冠状病毒的N蛋白抗原相关性。方法分别用基因重组SARS-CoV、229E和OC43N蛋白免疫BALB/c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光进行筛选和鉴定,同时用mAb分析3株人冠状病毒N蛋白之间的免疫交叉反应。结果获得多株抗SARS-CoV、229E和OC43 N蛋白mAb杂交瘤细胞株,ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光结果均显示,所有的mAb仅与各自病毒的N蛋白特异性反应,而在3株人冠状病毒N蛋白抗原之间不产生免疫交叉反应。结论获得的特异性抗人冠状病毒N蛋白mAb为进一步研究3株人冠状病毒的抗原决定簇相关性奠定了基础。

1型登革病毒初次感染患者血清中和抗体的动态反应分析

目的研究感染登革病毒(DENV)后,机体DENV中和抗体产生的特点及其动态变化规律。方法采集2006年DENV-1初次感染患者在发病2周之内的,以及同一组患者在2010年随诊期间的血清标本,用本实验室建立的以群特异性DENV NS1抗原捕获ELISA为基础的,可同时测定4型DENV中和抗体的微中和试验(ELISA-MNT),对这两组血清中的DENV中和抗体滴度进行检测。这两组血清标本均检测了全部抗4型DENV的中和抗体。此外,2010年的血清标本还检测了抗3种不同毒株的DENV-1(其中包括1株标准株和2株临床分离株)的中和抗体。结果 2006年和2010年这两组不同时间段的血清标本对全部4型DENV均可显示出一定程度的交叉中和抗体反应,其中,2006年的血清标本交叉中和抗体反应更为明显,表现为其最高的中和抗体针对的甚至是DENV-2,而不是预计中的DENV-1;2010年的血清标本中最高的中和抗体滴度针对的是同型的DENV-1。Mann-whitney U检验显示:对于同型的抗DENV-1中和抗体滴度,2010年的血清要明显高于2006年的血清(U=86.500,P=0.000),但异型中和抗体滴度在两组血清标本中无明显改变。Friedman检验显示,尽管同属DENV-1,但2010年的血清标本对3种不同毒株的DENV-1的中和抗体滴度之间还是存在显著差异(χ2=12.123,P=0.002)。结论 4型交叉中和抗体反应是DENV感染后,尤其是在感染早期中和抗体的产生特点,但只有同型DENV中和抗体滴度可随时间的推移而发生明显的上升;然而即使是同属于一种血清型,不同毒株之间的中和抗体也可能存在差异。

1组曲霉单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定一组抗曲霉不同抗原的单克隆抗体。方法采用烟曲霉细胞壁抗原成分、分泌抗原和灭活分生孢子,分别免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,免疫荧光法鉴定单克隆抗体与曲霉属和念珠菌属抗原的交叉反应。结果获得29株稳定分泌抗曲霉单抗的杂交瘤细胞株,其中用烟曲霉细胞壁抗原成分免疫获得11株,用分泌抗原免疫获得13株,用孢子免疫获得5株;Ig亚类鉴定,11个克隆株为IgG1亚类,3个克隆株为IgG3,15个克隆株为IgM。免疫荧光法鉴定29株单抗特异性识别烟曲霉细胞壁抗原,与其他曲霉抗原有交叉反应。结论29株单克隆抗体,对于建立侵袭性曲霉感染早期诊断方法、筛选曲霉保护性抗体以及研究抗体保护机制奠定了实验基础。

简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR(CODEHOP-PCR)在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。

一组曲霉单克隆抗体的制备及在免疫病理诊断中的研究

目的研究一组抗曲霉共同抗原的单克隆抗体,在病理组织切片中特异性诊断曲霉感染的免疫病理学方法。方法采用烟曲霉细胞壁抗原、分泌抗原和灭活分生孢子,分别免疫BALB/c小鼠,制备特异性的抗曲霉单克隆抗体,免疫荧光法鉴定单克隆抗体与曲霉属和念珠属抗原的交叉反应。以单克隆抗体检测侵袭性烟曲霉感染兔模型的肾、肝脏组织切片和SARS合并侵袭性曲霉感染患者和肺曲霉病患者的肺组织切片。结果特异性抗曲霉共同抗原的单克隆抗体可敏感检测组织病理切片中曲霉菌丝体抗原。结论抗曲霉共同抗原的单克隆抗体在免疫病理诊断中为确定组织中曲霉,区分真菌种属提供了有用的工具,具有很好的临床应用前景。

建立检测18种(型/亚型)呼吸道病毒的两种循环参数的实时荧光定量PCR

目的建立两种不同循环参数的实时荧光定量PCR,检测包括流感病毒、冠状病毒等18种（型/亚型）呼吸道病毒。方法引用文献报道的18种（型/亚型）呼吸道病毒引物和探针,建立两种不同循环参数的实时荧光定量PCR法,考核方法的敏感性、特异性和准确性,并用临床标本进行验证。结果成功建立了可检测18种（型/亚型）呼吸道病毒的两种不同循环参数的实时荧光定量PCR法;该法特异性较好,最低检测限为10拷贝数/μL,变异系数（CV）为1.26%~3.43%,重复性良好;408份临床标本中,用该法检测鼻拭子标本阳性率为63.2%（225/356）,肺泡灌洗液标本阳性率为25.0%（13/52）。结论建立的实时荧光定量PCR法简便、特异、敏感、稳定,适用于临床常见呼吸道病毒感染的早期诊断。

钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体的制备及鉴定

LipL32是钩端螺旋体外膜中含量最丰富的蛋白,有很好的免疫原性,且在致病性钩端螺旋体中高度保守。在非变性条件下纯化LipL32重组蛋白,与佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,取脾脏细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,然后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和有限稀释法分别进行筛选和细胞克隆,获得29株能稳定分泌抗LipL32单克隆抗体的杂交瘤细胞株,它们能识别8个LipL32抗原表位。用这些细胞株制备腹水型抗体,并对特性进行鉴定。用生物素标记这些抗体后两两配对,采用双抗夹心ELISA检测提取自15株致病性钩端螺旋体及其他致病菌的抗原,以评估单克隆抗体的灵敏度和特异度。筛选出1对灵敏度高和特异度好的单克隆抗体,ELISA检测rLipL32的最低浓度为1ng/ml。结果提示,该钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体及检测方法有很好的应用前景。

人冠状病毒229E、OC43与SARS-CoV血清学相关性的研究

目的检测正常人和SARS患者血清中3种人冠状病毒(229E、OC43和SARS-CoV)特异性抗体,分析3种冠状病毒血清学相关性。方法采用免疫印迹、免疫荧光和ELISA方法检测100例健康献血员、34例SARS患者恢复期以及11例SARS患者双份血清中229E、OC43和SARS-CoV 3种冠状病毒核衣壳(N)蛋白抗体。结果用免疫荧光方法检测100例健康献血员血清中229E、OCA3和SARS-CoV IgG阳性率分别为98％、100％和1％,34例SARS患者恢复期血清中3种冠状病毒IgG的阳性率均为100％;免疫印迹检测100例健康献血员血清中229E、OC43和SARS-CoV N蛋白IgG阳性率分别97％、99％和2％,34例SARS患者恢复期血清中229E、OC43和SARS-CoV N蛋白IgG阳性率分别97%、100％和100%;11例SARS患者的急性期和恢复期双份血清中,免疫荧光检测有5例出现229E IgG滴度4倍或以上升高,10例出现OC43 IgG滴度4倍或以上升高,ELISA检测2例出现229E N蛋白IgG滴度4倍以上升高,没有一例出现OCA3 N蛋白抗体滴度升高。结论正常人群中普遍存在229E和OC43两种人冠状病毒抗体,SARS-CoV感染者存在对人冠状病毒229E和OC43血清学交叉反应,提示核衣壳蛋白不是引起血清学交叉反应的主要抗原,结果对研究SARS溯源有重要意义。

SARS-CoV、HCoV-229E和OC43核衣壳蛋白的克隆表达及抗原相关性分析

目的克隆表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)和人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43)核衣壳(N)蛋白,并对其重组蛋白的抗原相关性进行探讨。方法RT-PCR扩增SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的N基因全长序列,克隆到原核表达载体pQE30,IPTG诱导表达重组蛋白,用Westernblot和免疫荧光鉴定。结果获得SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43His-N融合蛋白的相对分子质量(Mr)分别约为47×103、44×103、50×103,与相应预测值相符,Westernblot和免疫荧光证实,3种融合蛋白仅与相应的免疫血清特异性结合,3种蛋白的抗原性相互间无交叉反应。结论获得具有免疫原性的SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的核衣壳融合蛋白,其3种N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应。