植物PPDK基因在基因工程中的应用

PPDK基因是C4酶系统中催化CO2初级受体——磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的生成,是C4途径的专一性酶,也是C4植物能进行高光合作用的限速酶之一。利用转基因工程原理及方法将PPDK导入粮食作物中,从而提高其产量和抗性,已成为科研人员研究的重点。

植物石蜡切片的固定与保存

石蜡切片是观察植物组织构造常用的制片方法之一。活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡,才能清晰辨认其形态结构。重点研究了植物石蜡切片的固定与保存,拟为今后固定剂及固定方法的选择提供科学依据。

山西农业大学校园木本观赏植物分类研究

对山西农业大学校园现有的木本观赏植物进行了种类统计和鉴定,分析和研究了观赏植物的保护和利用,为更好地开发利用木本观赏植物提供科学依据。分类研究结果:校园内有木本植物58科,120属,255种,通过分析研究,被列为观赏植物的有31科,55属,88种,这些树种的观赏价值较高且种类丰富。

干细胞向生殖细胞分化的研究进展

胚胎干细胞(ESC)是一种多能干细胞,具有向生殖细胞分化的能力,由于具有致瘤性和伦理问题,限制了ESC向临床应用发展的前景。成体干细胞(ASC)也是一类多能干细胞,理论上也能分化为生殖细胞,但诱导分化过程往往受到阻滞。诱导性多能干细胞(iPS)是一种具有多能性的重编程体细胞,一定程度上可替代ESC用于基础和临床研究。目前,全球不孕不育的发生率呈逐年递增的趋势,充分认识干细胞向生殖细胞分化的机制是解决该难题的重要理论前提。就各种干细胞向生殖细胞分化的研究进展作一综述。

白血病抑制因子及其受体在原发性不孕症患者子宫内膜中的表达分析

目的探讨白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)及其受体(leukemiainhibitoryfactor receptor,LIFR)在原发性不孕症患者种植窗期子宫内膜中的表达情况,分析其与不明原因不孕症的关系。方法采用前瞻性临床对照研究方法,随机选择本院2015年7月～2017年7月诊治的原发性不孕症患者200例为观察组,按照不同的发病原因等分为4个亚组:A组(输卵管闭塞)、B组(卵巢功能低下)、C组(子宫内膜异位)及D组(不明原因),同时选择同期健康志愿者50例为对照组。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,分别检测各组研究对象LIFm RNA和LIFRm RNA表达水平,比较组间差异。结果对照组LIFmRNA表达水平为(1.12±0.46),A、B、C、D四个亚组则分别为(1.03±0.33)、(0. 90±0. 30)、(0. 99±0. 38)和(0. 50±0. 31)。A、 B、C三组L I Fm R N A表达水平和对照组的差异无统计学意义(P均>0.05),而D组LIFmRNA表达水平明显低于对照组(P <0.01),组间比较D组和A、B、C三组的差异均有统计学意义(P均<0.01)。A、B、C、D四个亚组LIFRmRNA表达水平均较对照组明显下降(P <0.01),而亚组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论女性不孕群体子宫内膜内LIFR显著受损,推断LIFR可能是调节女性子宫内膜种植窗期受孕的关键因子之一。LIF表达缺失可能与不明原因的不孕症发病有关。

我院227例输卵管性不孕患者生殖道支原体感染及药敏结果分析

目的:研究输卵管性不孕患者生殖道支原体感染现状及耐药情况。方法:将我院2015年1月至2017年6月227例输卵管性不孕患者纳入不孕组,选取同期在我院进行孕前检查的100例健康女性志愿者为对照组,采集宫颈分泌物进行支原体培养、鉴定与药敏试验。结果:227例输卵管性不孕患者共检出129例生殖道支原体感染,包括66例解脲支原体感染、38例人型支原体感染、25例解脲支原体+人型支原体感染。不孕组生殖道支原体总感染率为56.8%显著高于对照组的14.0%(χ2=51.746,P=0.000)。解脲支原体对强力霉素与美满霉素最敏感,敏感率均为93.9%;对克拉霉素耐药性最高,耐药率为56.1%。人型支原体对四环素与强力霉素最敏感,敏感率均为94.7%;对罗红霉素耐药性最高,耐药率为68.4%。解脲支原体+人型支原体对强力霉素最敏感,敏感率为88.0%;对阿奇霉素耐药性最高,耐药率为92.0%。不孕组解脲支原体、人型支原体、解脲支原体+人型支原体感染率及生殖道支原体总感染率显著高于对照组(P<0.05)。结论:生殖道支原体感染以解脲支原体感染为主,呈多重耐药性,临床治疗应在药敏试验结果指导下进行。

长基因间非编码RNA 472靶向微小RNA-942-5p对非小细胞肺癌细胞上皮间质转化的影响

目的探讨长基因间非编码RNA 472(LINC00472)靶向调控微小RNA-942-5p(miR-942-5p)表达及对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用GEPIA分析来自TCGA数据库的969例NSCLC组织(483例腺癌+486例鳞癌)的LINC00472水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测正常肺上皮细胞BEAS-2B及NSCLC细胞系(NCI-H157、NCI-H1975和A549)的LINC00472水平。构建LINC00472过表达质粒pcDNA3.1-LINC00472并采用脂质体法转染A549细胞,根据转染质粒分为3组:未转染任何质粒的空白对照组、转染pcDNA3.1质粒的阴性对照组和转染pcDNA3.1-LINC00472质粒的过表达组。MTT比色法、划痕实验和Transwell小室实验检测A549细胞的增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,qPCR和Western blotting检测EMT相关因子E-钙黏蛋白(E-cad)、N-钙黏蛋白(N-cad)和波形蛋白(Vim)的水平,LncBase预测LINC00472与miR-942-5p的结合序列并经荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系。结果GEPIA在线分析显示,NSCLC组织的LINC00472水平低于正常组织(P<0.05);NSCLC细胞的LINC00472水平均低于BEAS-2B细胞(P<0.05),选取水平最低的A549细胞进行后续功能实验。过表达组的LINC00472和E-cad水平升高,而miR-942-5p、N-cad和Vim水平降低(P<0.05)。过表达组转染48、72 h后的增殖活力低于其余两组(P<0.05)。过表达组的划痕愈合率为(29.148±3.034)%,低于空白对照组的(84.517±8.722)%和阴性对照组的(87.479±5.672)%,穿膜细胞数为(144.437±12.178)个,亦低于空白对照组的(240.365±14.156)个和阴性对照组的(224.713±17.805)个,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光素酶活性检测结果显示,miR-942-5p模拟物能抑制LINC00472野生型质粒的荧光素酶活性(P<0.05),但对突变型无影响(P>0.05)。空白对照组和阴性对照组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05)。结论LINC00472在NSCLC组织和细胞中表达均下调,增强LINC00472表达可抑制NSCLC细胞的EMT和侵袭迁移能力,可能通过靶向miR-942-5p来发挥抑癌作用,LINC00472/miR-942-5p轴在NSCLC防治中有一定潜能。

多重荧光PCR法和免疫荧光法诊断常见急性呼吸道病毒感染的一致性研究

目的观察多重荧光PCR法和免疫荧光法在辅助诊断急性呼吸道感染(acute respiratory infection,ARI)中的一致性。方法对2021年12月至2022年4月山东阳光融和医院620例急性呼吸道感染住院病例采集咽拭子标本,分别采用多重荧光PCR法和免疫荧光法检测6种呼吸道感染病原体(甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒Ⅰ型及副流感病毒Ⅲ型),以评估两种方法在诊断呼吸道病毒感染中的一致性、灵敏性、特异性。结果620例ARI标本中,多重荧光PCR法检测阳性率高于免疫荧光法,差异具有统计学意义(χ^(2)=26.28,P<0.005)。两种方法显示乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒检出率最高,其次是腺病毒、副流感病毒Ⅲ型。结论多重荧光PCR法检测6种呼吸道病毒阳性率显著高于免疫荧光法,且与临床表现更相符,提示其对于呼吸道病毒检测有更好的临床应用价值。

褪黑素对精神障碍大鼠星形胶质细胞极化的作用及机制研究

目的基于Nrf2-HO-1/CYP2E1通路探讨褪黑素调控精神障碍大鼠星形胶质细胞极化的作用机制。方法将50只大鼠随机分为假手术组、模型组、褪黑素组、Nrf2抑制剂(ML-385)组及褪黑素+ML-385组,采用刀片切割法损伤大鼠额叶皮质,复制精神障碍模型。糖水偏好和旷场实验检测大鼠行为学变化;HE和Nissl染色观察大鼠额叶皮质病理损伤和神经元损伤情况;免疫荧光染色检测大鼠额叶皮质GABA能神经元标记物GAD67、A1与A2型星形胶质细胞C3/GFAP与S100A10/GFAP表达;Western blot检测大鼠额叶皮质Nrf2-HO-1/CYP2E1通路相关蛋白Nrf2、HO-1、CYP2E1表达。结果与模型组相比,褪黑素组大鼠糖水偏好指数、跨格次数和站立次数显著提高,额叶皮质病理损伤减轻、神经元数量明显增加,大鼠额叶皮质GAD67表达水平显著升高、C3/GFAP表达水平显著降低、S100A10/GFAP表达水平显著升高,Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高,CYP2E1蛋白表达水平显著降低;然而褪黑素对精神障碍大鼠的上述作用均被ML-385削弱或抑制。结论褪黑素可能通过调控Nrf2-HO-1/CYP2E1通路活性促进A1型星形胶质细胞向A2型极化,进而改善大鼠精神障碍状态。

籽粒苋苹果酸酶(NAD-ME)基因密码子偏好性分析

遗传密码子是生命信息的基本遗传单位,每种氨基酸对应1～6个同义密码子.特定物种在长期进化中形成了适应自身基因组环境的密码子使用偏性.运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析自主克隆的籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性,并与马铃薯等7种植物的ME基因密码子偏好性进行比较,以期为该基因在作物遗传改良中选择合适的受体植物提供依据.结果表明,籽粒苋NAD-ME基因偏好于以A或T结尾的密码子,其它几种被比较作物的ME基因也有同样的趋势,但双子叶植物的偏好性更强.基于NAD-ME基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明,籽粒苋与马铃薯、拟南芥、葡萄、蓖麻、毛果杨等双子叶植物聚为1类,玉米和高粱这2个单子叶植物聚为1类,预示籽粒苋NAD-ME基因更适合导入马铃薯等双子叶植物.对籽粒苋NAD-ME基因的密码子偏好性与大肠杆菌和酵母的基因组密码子偏好性进行比较,发现均存在差异,与大肠杆菌的差异高于酵母,表明酵母表达系统要优于大肠杆菌表达系统.若要进一步提高籽粒苋NAD-ME基因在大肠杆菌或酵母中的表达水平,尚需对其密码子进行优化.

籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及其特征分析

丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)是C4植物在光合过程中的关键限速酶之一。本研究采用RT-PCR 技术,从籽粒苋叶片中克隆到籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶基因cDNA全长。核苷酸序列分析表明,该基因cDNA序列开放阅读框全长为2 871 bp (GenBank 登录号: JF907701.1),可编码956 个氨基酸,分子量为104 kD。籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶PPDK 与长寿花(Kalanchoe fedtschenko)、冰叶日中花(M.crystallinum)和板栗(Castanea mollissima)等双子叶植物PPDK 的同源性较高,分别为82.5%、82.0%和81.4%;与稗草(Echinochloa crusgalli)、高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)等单子叶植物PPDK 的序列一致性分别为74.5%、74.5%和73.9%。进化树分析表明,其与禾本科植物长寿花最为接近。半定量RT-PCR 研究表明,该基因受光诱导而上调表达,且在绿色叶片中的表达水平最高。克隆籽粒苋PPDK 基因将为今后作物高光效分子育种提供备选基因。

耐热β-半乳糖苷酶(Pyrococcus furiosus DSM 3638)活性位点N415S点突变对其酶活性的影响

β-半乳糖苷酶具有将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖的能力,也具有把半乳糖聚合成低聚半乳糖的能力。这两种能力在工业生产中具有不同的意义。通过点突变使β-galactosidase[Pyrococcus furiosus DSM 3638]415位天冬酰胺(Asn or N)突变为丝氨酸(Ser or S),突变体构建于毕赤酵母表达质粒载体,并筛选以毕赤酵母为宿主细胞的工程菌种,以此制备β-半乳糖苷酶的突变体酶蛋白。研究发现,该突变体的β-半乳糖苷酶活性在95℃、p H5.5时达到最高酶活,为耐高温乳糖酶,且该突变体水解牛奶的能力较好,可用于低乳糖牛奶及其相关制品加工中。而突变后β-半乳糖苷酶的另一个活性,即产生低聚半乳糖的能力的活性也有所提高,但不够明显。因此该位点突变可用于乳制品的加工,但不能期盼产生更多的半乳糖寡聚体。