E3泛素连接酶RNF165在A亚群禽白血病病毒复制中的作用

【目的】探明鸡源环指蛋白165(ring finger protein 165,RNF165)在A亚群禽白血病病毒(ALV-A)复制中的作用,为进一步研究鸡源RNF165对ALV-A致病性的影响提供参考。【方法】将ALV-A接种于DF-1细胞和1日龄雏鸡,通过Western blotting和实时荧光定量PCR方法分别从体外和体内两个方面验证ALV-A对宿主RNF165表达的影响;参考已公布的RNF165基因序列设计过表达引物,通过PCR扩增RNF165基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1;将验证表达的重组质粒转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,使用Western blotting检测过表达RNF165对病毒复制的影响;最后设计突变引物,构建RNF165功能结构域突变质粒,将过表达质粒和突变质粒分别转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,Western blotting测定gp85蛋白表达差异。【结果】ALV-A感染DF-1细胞后未能检测到内源性的RNF165蛋白,但基因转录水平较对照组明显下调(P<0.01)。在体内试验中,与对照组相比,感染病毒雏鸡肝脏中RNF165基因和蛋白表达水平均有所下调(P<0.01);通过PCR成功扩增到大小为1068 bp的目的片段并成功克隆至pcDNA3.1,Western blotting结果显示,在39 ku处出现目的条带,RNF165过表达后促进了病毒复制;测序结果显示,成功构建出功能结构域突变质粒,与过表达质粒组相比,RNF165突变质粒组病毒的复制水平受到显著抑制。【结论】ALV-A感染抑制DF-1细胞和雏鸡肝脏RNF165的表达,在体外试验中,过表达RNF165会促进ALV-A的复制,且这种影响与其保守结构域有关。

鸡IFIT5对J亚群禽白血病病毒在DF-1细胞内复制的影响

【目的】制备鸡干扰素诱导蛋白含三角形四肽重复5(IFIT5)多克隆抗体,以探究IFIT5对J型禽白血病病毒(ALV-J)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以感染ALV-J的鸡脾脏组织细胞提取的RNA反转录获得的cDNA作为模板,对IFIT5基因进行PCR扩增,利用重组酶将纯化后的PCR产物和线性化载体进行连接,构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5并测序。将测序正确的重组质粒pET-28a-IFIT5转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,表达的融合蛋白His-IFIT5纯化后免疫6周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,通过Western blotting鉴定抗体的特异性,利用间接ELISA测定抗体的效价。将测序正确的重组质粒pcDNA5-flag-IFIT5转染DF-1细胞,24 h后接种ALV-J,通过Western blotting检测DF-1细胞中过表达IFIT5对ALV-J复制的影响。【结果】试验成功扩增到大小为1 440 bp的IFIT5基因,并成功构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5。pET-28a-IFIT5可以表达约56 ku的可溶性蛋白His-IFIT5,Western blotting结果显示,制备的鼠抗IFIT5蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的IFIT5蛋白,效价为1∶32 000。pcDNA5-flag-IFIT5能在DF-1细胞中高效表达,且在DF-1细胞中过表达IFIT5可以促进ALV-J复制。【结论】本研究制备的鼠抗IFIT5蛋白多克隆抗体具有较高的反应性和特异性;在DF-1细胞中过表达IFIT5可以促进ALV-J复制。本试验结果为深入研究IFIT5蛋白的生物学功能提供参考。

鸡RNF165蛋白多克隆抗体制备及其生物信息学分析

【目的】制备鸡环指蛋白165(RNF165)多克隆抗体并对RNF165蛋白进行生物信息学分析,以期为研究鸡RNF165的生物学功能提供参考。【方法】以鸡胚成纤维细胞(DF-1)为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,通过PCR扩增RNF 165基因,将其连接至pET-28a(+)质粒构建重组表达质粒pET-28a-RNF165。将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,将表达的融合蛋白纯化后按照制定的免疫程序免疫7周龄BALB/c雌鼠。第3次免疫7 d后,分离小鼠血清,用Western blotting检测鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定其效价。使用在线生物信息学软件对RNF165蛋白理化性质、信号肽、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和保守结构域进行分析。【结果】成功扩增得到大小为1068 bp的RNF165基因。成功构建原核表达载体pET-28a-RNF165,并诱导表达出约43 ku的RNF165蛋白。Western blotting结果显示,制备的鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的RNF165蛋白,效价为1∶32000。生物信息学分析结果显示,RNF165蛋白由350个氨基酸组成,分子质量为39.88 ku,等电点为7.13,不稳定指数为69.87,为亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构域,有29个磷酸化位点;RNF165蛋白二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成;RNF165出现在细胞核内的概率最高,为47.8%;RNF165蛋白质C-端296―341位氨基酸残基为RING-Ubox超家族保守结构域。【结论】本研究所制备的鼠抗RNF165多抗隆抗体具有较高的反应性和特异性,RNF165蛋白为亲水性蛋白,主要在细胞核内表达,结果可为研究RNF165蛋白的生物学功能提供材料支持。

禽白血病病毒K亚群HB2018003株感染性克隆构建

为了获得背景明确清晰的禽白血病病毒K亚群(ALV-K)毒株,对地方性ALV-K毒株HB2018003采用酶切和同源重组两种方法进行感染性克隆构建及病毒拯救。使用PCR方法获得目的基因,经酶切、连接和同源重组后成功构建重组质粒Topo-003-ABC和Topo-003-K12,测序结果表明无任何突变,进而将重组质粒转染进鸡胚成纤维细胞(DF-1)中,经群特异性抗原P27 ELISA、PCR和间接免疫荧光(IFA)鉴定,结果均表明成功拯救出病毒,将其命名为R-rHB2018003(同源重组法)和E-rHB2018003(酶切法)。本研究为深入探讨ALV-K的致病机制奠定了基础。

REV囊膜蛋白的原核表达、抗体制备及鉴定

【目的】禽网状内皮增生症病毒(reticuloendothelial virus,REV)囊膜蛋白与细胞表面受体结合启动病毒感染,并在REV的复制、致病过程中具有重要作用。为探索REV囊膜蛋白相关生物学特性,研究获得了高效表达的禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白,制备多克隆抗体。【方法】利用原核表达载体pET-28a和pGEX-6p-1表达REV囊膜蛋白gp90,并通过Ni2+亲和层析柱对融合蛋白REV-His-gp90进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备了多克隆抗体;纯化的REV-GST-gp90蛋白用于检测多克隆抗体效价。【结果】pET-28a-REV-gp90和pGEX-6p-1-REV-gp90表达质粒构建成功,通过SDS-PAGE验证蛋白能在大肠杆菌BL21菌株中表达;Western-blot检测结果显示制备的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性;采用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶64000;IFA结果显示,制备的多克隆血清能与REV特异性反应。【结论】研究制备的多克隆抗体效价高、特异性良好,为进一步开展REV囊膜蛋白的生物学特性研究及其特异性抗体应用奠定基础。

γ-氨基丁酸与延胡索乙素配伍对小鼠急性疼痛模型的镇痛作用

为了了解中药延胡索乙素(L-THP)与γ-氨基丁酸(GABA)配伍对动物模型的镇痛作用,试验以小鼠急性疼痛为模型,以布洛芬、吗啡为参照药物,通过小鼠醋酸扭体试验和小鼠甲醛致痛试验,分别观察记录用药小鼠在注射致痛剂后20 min内的扭体次数和舔注射足时间。结果表明:LTHP与GABA配伍,在25~200 mg/kg浓度时具有良好的外周镇痛作用,能明显抑制醋酸致小鼠扭体反应。甲醛致小鼠的Ⅱ相疼痛反应,L-THP与GABA配伍的作用强于或等于布洛芬;而对甲醛致小鼠的Ⅰ相疼痛反应,L-THP与GABA配伍的作用与布洛芬相似,弱于吗啡,说明L-THP与GABA配伍可用于疼痛应急疾患。