牙髓干细胞通过调节氧化应激修复肺微血管内皮细胞低氧损伤

目的探讨牙髓干细胞(DPSC)对肺微血管内皮细胞(PMVEC)低氧损伤的修复作用及机制。方法①建立PMVEC低氧损伤模型,用氯化钴0(细胞对照),10,25,50和100μmol·L^(-1)处理PMVEC 72 h,CCK-8法检测细胞存活率,Western印迹法检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和闭合蛋白(OCLN)的蛋白表达水平。②设细胞对照组、模型组和模型+DPSC组,免疫荧光法检测细胞活性氧(ROS)水平;Western印迹法检测ZO-1和OCLN蛋白水平。③设模型组、模型+DPSC组和模型+DPSC敲低超氧化物歧化酶1(SOD1)组,Western印迹法检测ZO-1和OCLN蛋白水平。结果①与细胞对照组相比,氯化钴100μmol·L^(-1)处理PMVEC后细胞存活率>80%,HIF-1α蛋白水平升高(P<0.05),ZO-1和OCLN蛋白水平降低(P<0.01),PMVEC低氧损伤模型构建成功。②与细胞对照组相比,模型组ZO-1和OCLN蛋白水平降低(P<0.01),ROS水平升高(P<0.01);与模型组相比,ZO-1和OCLN蛋白水平升高(P<0.05),模型+DPSC组ROS水平降低(P<0.01);③与模型组相比,模型+DPSC组ZO-1和OCLN蛋白水平升高(P<0.01);与模型+DPSC组相比,模型+DPSC敲低SOD1组ZO-1和OCLN蛋白水平降低(P<0.01)。结论DPSC通过调节氧化应激修复PMVEC低氧损伤。

间充质干细胞衍生的胞外囊泡治疗肺部疾病的研究进展

肺部疾病主要是指肺脏本身的疾病或者是疾病的肺部表现,大多是因暴露于污染的环境或是职业因素,引起的肺脏不同程度的损伤,因此肺部疾病具有较高的发病率。根据肺部疾病的发病过程不同可以将其分为慢性肺部疾病和急性肺损伤。无论是哪种肺部疾病,一般都会引起抗炎因子(促炎因子)和抗纤维化因子(促纤维化因子)的平衡紊乱,从而导致组织损伤[1]。目前针对不同肺部疾病,大多采用以抗菌类、抗病毒类、糖皮质激素等药物为主的对症治疗。针对部分气管、支气管疾病也可采用介入治疗,部分严重的肺部疾病则需选择手术治疗。这些治疗手段的疗效和预后尚需进一步提高,因此,亟需寻找新的治疗策略。

线粒体示踪体系的建立及验证

目的通过构建稳定表达线粒体荧光报告系统的牙髓干细胞(DPSC)建立线粒体示踪体系,并采用该示踪体系研究间充质干细胞(MSC)向辐射损伤细胞输送线粒体。方法①构建质粒pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2(简称COX8A-DsRed2),并进行基因测序和PCR鉴定;COX8A-DsRed2用293T细胞包装获得慢病毒(Lv-COX8A-DsRed2)并感染DPSC,采用荧光显微镜观测红色荧光蛋白DsRed2在DPSC线粒体的稳定表达(DPSC-COX8A-DsRed2)。②在DPSC-COX8A-DsRed2中使用荧光染色法观察DsRed2荧光蛋白与线粒体膜受体线粒体外膜转位酶20(TOMM20)和线粒体示踪试剂MitoTracker Green的共定位。③采用10 Gy X射线照射大鼠小肠隐窝上皮细胞系IEC-6建立细胞辐射损伤模型,并使用5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)荧光染料标记IEC-6细胞;于照射后,立即加入DPSCCOX8A-DsRed2,继续培养24 h,荧光显微镜观察DPSC-COX8A-DsRed2能否向辐照受损细胞递送线粒体。结果①载体成功插入基因COX8A和DsRed2基因序列,COX8A-DsRed2构建成功;DPSC-COX8ADsRed2细胞内表达红色荧光DsRed2;②荧光染色法结果显示,红色荧光报告系统DPSC-COX8ADsRed2与线粒体膜受体TOMM20、线粒体示踪试剂MitoTracker Green共定位于细胞线粒体;③DPSCCOX8A-DsRed2与辐射损伤IEC-6细胞共培养,荧光显微镜可观测到绿色荧光的IEC-6细胞中出现DPSC来源的红色荧光标记的线粒体,表明DPSC与IEC-6之间发生了线粒体转移。结论构建的线粒体荧光探针能够准确指示线粒体的转移,为下一步研究间充质干细胞线粒体转移在辐射损伤救治中的作用提供了理想工具。

相同剂量分割照射与单次照射对小鼠放射性心脏损伤的影响

目的探索相同剂量分割照射与单次照射对小鼠放射性心脏损伤的影响。方法野生型C57BL/6J小鼠21只,随机分为正常对照组、分割照射组和单次照射组。采用18 Gy X射线,对小鼠心脏分别进行分割(3 Gy/次,6次)和单次照射,建立放射性心脏损伤模型。照射后7和28 d通过全自动生化分析仪检测小鼠心肌酶损伤标志物肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和LDH1,以及外周血清离子(K^(+)、Ca^(2+)、Fe^(2+)和Cl^(-))的浓度;照射后28 d检测小鼠心脏功能,记录并分析左心室射血分数(EF)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室质量(LV mass)和左心室收缩末期容积(LVESV)的变化;激光共聚焦显微镜观察心肌细胞线粒体膜通道孔(mPTP)开放和线粒体膜电位的改变;透射电镜观察心肌超微结构;Masson染色观察心肌纤维化;油红染色观察主动脉粥样硬化;实时定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹检测凋亡相关基因与蛋白B细胞淋巴瘤-2相关蛋白X(BAX)和胱天蛋白酶3(casepase-3)的表达。结果18 Gy X射线照射后7 d,单次照射组小鼠CK、CK-MB、LDH和LDH1的表达水平均显著升高或有升高趋势,而分割照射组仅有CK和LDH1出现升高趋势。照射后28 d,2种照射方式均可导致心肌酶谱4种酶的表达水平升高。照射后7和28 d,2种照射方式均可导致血清离子K^(+)、Fe^(2+)、Ca^(2+)和Cl^(-)的浓度明显降低。2种照射方式都会导致EF和FS降低,LV mass、LVEDV和LVESV升高,2组之间EF和FS的差别具有统计学意义。分割照射和单次照射均会导致mPTP和膜电位的降低,其中单次照射组的改变更加显著,2组之间的差异具有统计学意义。电镜观察发现,X射线照射后心肌细胞线粒体嵴减少,空泡化形成以及心肌纤维束增粗。Masson染色可见,X射线照射后小鼠心肌组织胶原纤维沉积,单次照射组更明显。主动脉大体油红染色发现,2种照射方式均会对小鼠主动脉造成损伤,单次照射组粥样硬化斑块的面积比更大,与分割照射组之间差异存在统计学意义。RT-qPCR和Wester印迹结果显示,X射线照射可导致心肌组织凋亡相关BAX和casepase-3的表达水平增加,在核酸水平单次照射组升高更显著,与分割照射组之间的差异具有统计学意义。结论相同剂量分割照射和单次照射都会造成小鼠心脏损伤,2种方式均可用于建立放射性心脏损伤模型;单次照射对小鼠心脏造成的损伤更加显著,可根据实际需求选择不同造模方式。

牙髓干细胞预防大鼠高原肺水肿的实验研究

目的评价牙髓干细胞(DPSC)对高原肺水肿(HAPE)的预防作用并初步探讨其作用机制。方法Sprague⁃Dawley大鼠21只,随机分为正常对照组(Control)、高原肺水肿组(HAPE)和DPSC预防组(DPSC)。模拟高原环境前3 d和前1 d,DPSC组大鼠尾静脉注射DPSC,Control组和HAPE组尾静脉注射相同体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。将HAPE组和DPSC组大鼠置于低压低氧模拟舱内,模拟海拔6000 m环境,建立大鼠HAPE模型。3 d后对各组大鼠解剖,制作肺组织切片,苏木精⁃伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化;记录大鼠肺干/湿重;BCA法检测肺组织匀浆总蛋白浓度;实时荧光定量PCR(RT⁃PCR)和Western印迹检测肺组织水通道蛋白1(APQ⁃1)表达;比色法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆血管活性物质浓度;ELISA法和RT⁃PCR法分别检测血清和肺组织炎症因子的表达。结果低压低氧环境处理3 d,HAPE组大鼠肺内炎细胞浸润增加、肺泡壁增厚、肺泡间质水肿、渗出增多,DPSC预防可显著减轻肺脏的组织病理学损伤。HAPE组大鼠的肺水含量(LWC)和肺组织匀浆总蛋白含量显著升高,DPSC预防组可显著降低LWC和肺组织匀浆总蛋白,二者之间差异具有统计学意义(P<0.01)。HAPE组肺组织中AQP⁃1蛋白与核酸表达水平显著降低,DPSC预防可增强AQP⁃1在肺组织的表达。HAPE组血浆扩血管活性物质一氧化氮(NO)和前列环素(PGI2)显著降低,而DPSC预防可显著升高血浆扩血管活性物质的表达。HAPE组血清和肺组织炎症因子白细胞介素⁃1α(IL⁃1α)和肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)表达显著升高,DPSC组血清和肺组织炎症因子表达显著降低。结论DPSC可通过促进水通道蛋白表达和提高血浆扩血管物质的含量,以及降低血清及肺组织炎症因子表达,从而预防大鼠高原肺水肿的发生。