香猪MAP3K4基因结构变异多态性和基因表达研究

基于前期比较基因组学分析,在香猪的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4,MAP 3K4)基因第15内含子中发现一个189 bp的结构变异(MAP3K4-I15-sv189)。为探究该结构变异(structural variation,SV)在香猪群体中的多态性分布及其对基因表达的影响,本研究设计一对特异性引物,建立MAP 3K4基因SV的PCR检测技术,分析香猪群体中该结构变异的基因类型;采用RT-qPCR研究结构变异不同基因型之间基因的差异表达。结果显示,香猪群体中MAP3K4-I15-sv189位点存在两种基因型,DD型和ID型(D为缺失基因,I与参考基因一致),其中D等位基因的频率为97.35%;大白猪群体中检测到3种基因型,DD型、ID型和II型,D等位基因频率为80%。相比之下,香猪的D等位基因频率显著高于大白猪的相应值(P<0.05)。采用生物信息学方法分析结构变异区域得到多种剪接元件和重复元件,可能影响MAP 3K4基因的表达。比较香猪各组织中MAP 3K4基因的表达量,发现该基因在肺组织的表达量最高。进一步检测肺组织中3种结构变异类型的相对表达量,显示:DD型>ID型>II型,表明SV的缺失可能促进MAP 3K4基因的表达。本研究表明,香猪MAP 3K4的结构变异MAP3K4-I15-sv189以缺失型为主,缺失型可促进肺组织MAP 3K4基因的表达。研究结果有助于解析香猪易感肺部疾病的分子机制。

宰后猪肉成熟过程中基因表达变化及其与肉品质的相关性分析

【目的】研究宰后成熟对猪肉品质的影响,以及宰后成熟过程中基因表达规律与猪肉品质变化的相关性,以期更好地阐释鲜肉成熟过程中肉品质变化的机理。【方法】以4℃条件下贮藏的大白猪背最长肌为研究对象,测定贮藏0、1、2、4、6、8和10 d时肉品质变化状况;利用实时荧光定量PCR测定宰后猪背最长肌中单磷酸腺苷脱氨酶3(AMPD3)、肌球蛋白结合蛋白C2(MYBPC2)、肌球蛋白轻链3(MYL3)、左旋氨基酸转运体(SLC7A8)和原肌球蛋白3(TPM3)等基因的表达变化,并分析其与肉品质指标的相关性。【结果】大白猪宰后背最长肌pH在2 d时达到极限值6.5,显著低于4、10 d(P<0.05);蒸煮损失和滴水损失均呈现先升高后降低的趋势,而贮藏损失在10 d时达到最高值12.52%,显著高于0.5~6 d(P<0.05);剪切力在宰后成熟1~10 d显著低于0~1 d(P<0.05);硫代巴比妥酸反应物(TBARS)值随成熟时间的延长逐渐升高,且8~10 d显著高于其他时间点(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,宰后肌肉组织中基因的转录丰度仍然存在,AMPD 3基因在贮藏6 d时表达水平显著高于0、0.5、2和10 d(P<0.05);MYBPC 2、MYL 3和TPM 3基因0~10 d表达量均呈时间依赖性上调,在贮藏10 d时表达水平显著高于0~2 d(P<0.05);SLC 7 A 8基因在贮藏2 d时表达量达到峰值,显著高于其他时间点(P<0.05)。相关性分析表明,AMPD 3基因与猪肉品质指标间没有相关性(P>0.05);MYBPC 2基因表达量与TBARS值和贮藏损失呈显著正相关(P<0.05);MYL 3基因表达量与TBARS值、剪切力、滴水损失及贮藏损失呈极显著或显著正相关(P<0.01;P<0.05),与蒸煮损失呈极显著负相关(P<0.01);SLC 7 A 8基因表达量与pH呈显著负相关(P<0.05);TPM 3基因表达量与TBARS值、滴水损失及贮藏损失呈显著或极显著正相关(P<0.05;P<0.01),与蒸煮损失呈显著负相关(P<0.05)。【结论】宰后猪肉成熟过程中基因表达变化与肉品质指标间存在相关性,基因表达的差异影响着动物屠宰后不同的代谢类型和生理功能,进而影响肉品质。

发情周期对香猪卵巢生物钟相关基因表达的影响

生物钟在生物体(如猪)的生殖系统中起着重要作用。为研究发情周期对香猪卵巢生物钟相关基因表达的影响,本研究分析了香猪卵巢在发情期和未发情期生物钟相关基因的表达和可变剪接。结果在香猪卵巢中共检测到90个生物钟相关基因的表达,其中有33个生物钟相关基因在发情期和未发情期差异表达。从34个生物钟相关基因的转录本中鉴定出44个差异可变剪接事件。此外,还发现包括核心时钟成分arntl和cry1在内的20个基因仅在可变剪接水平上被差异调节,包括per1和clock在内的14个基因同时在基因表达和可变剪接水平被差异调节。通过RT-qPCR实验,证实了核心时钟基因per1、cry1、clock和arntl以及时钟相关基因ppp1cb和ntrk1在香猪卵巢中的表达具有节律性。结果表明,香猪卵巢生物钟可能通过转录和转录后调控水平在调节卵巢生理功能中发挥着重要作用。

香猪皮肤转录组衰老相关病毒源基因的筛选和鉴定

皮肤是哺乳动物抵御致病因素的第1道防线,在皮肤衰老的过程中,整合到哺乳动物基因组中的病毒源基因序列会被重新激活,影响宿主基因的表达,激起细胞对病毒的反应,引起慢性炎症、促进细胞衰老。本研究旨在探究病毒源基因表达与皱皮香猪皮肤皱纹形成的关系,选取12~18月龄皱皮香猪和普通香猪各5头进行转录组测序和生物信息学分析,采用RT-qPCR方法对皱皮香猪中差异表达的病毒源基因进行验证。2组中皮肤组织差异表达基因与病毒整合位点数据库进行比对分析,筛选出612个差异表达的病毒源基因。以普通香猪为对照,得到上调基因182个,下调基因430个,这些差异表达的病毒源基因主要富集在皮肤发育、炎症反应等GO条目,以及长寿调控途径、FoxO信号通路、细胞衰老等KEGG通路。经猪-人同源基因转换,与免疫、衰老、人类皮肤相关的基因取交集,筛选出高表达的候选基因6个:AGT、CAT、CTNNB1、JUP、KRT75和LIPE,采用RT-qPCR验证了皮肤中这6个基因的差异表达,与转录组测序结果趋势一致。研究结果表明,皱皮香猪皮肤皱纹的形成与病毒源基因的异常表达有紧密联系,本研究可为后期皱皮香猪皮肤褶皱形成的分子机制及衰老分子标记物选择奠定理论基础。

香猪ADCY2基因结构变异鉴定及其与生长性状的关联分析

为了探究香猪腺苷酸环化酶2(Adenylate Cyclase,ADCY2)基因结构变异与香猪生长性状的关系,本研究以233头断奶香猪为实验动物,定期测量体尺指标,采集耳组织提取基因组DNA,利用PCR技术分析香猪ADCY2基因结构变异的遗传多样性,并与香猪体尺指标进行相关性分析。结果显示,香猪ADCY2基因中存在1个长度为305 bp的结构变异位点(ADCY2-I2-SV305),该位点检出3种基因型:纯合缺失DD型、正常的II型和杂合的ID型,其中II基因型频率(67.09%)显著高于ID和DD基因型;I等位基因为优势等位基因。ADCY2-I2-SV305位点与香猪多个日龄的体宽、胸围和腹围显著相关,且II基因型的香猪个体各项体尺指标均显著高于ID和DD型个体,提示该结构变异的缺失型不利于香猪生长发育。对ADCY2-I2-SV305变异位点的功能元件分析发现,该位点中含有1个简单重复元件和1个SINE元件,以及5个miRNA结合位点,推测该位点的缺失突变将导致这些重复元件的丢失,不利于ADCY2基因的表达,进而影响香猪生长发育。综上,ADCY2基因的ADCY2-I2-SV305结构变异与香猪生长发育显著相关,可作为香猪良种选育的分子标记。

青黛复方制剂调节猪免疫力的作用机制分析

试验旨在应用网络药理学方法,探究青黛复方制剂调节猪免疫力的分子机制。从Tcmsp数据库中筛查青黛复方制剂含有的化合物,得到有效活性成分,预测有效活性成分作用的靶基因,制作“活性成分-靶基因”网络分析,筛出主要活性成分。通过Omim等数据库分析免疫相关基因,与活性成分的靶基因取交集,得到复方制剂靶向的猪免疫相关基因。利用String数据库构建蛋白互作网络图(PPI),运用Cytoscape筛选PPI的核心蛋白;通过David数据库分析靶基因富集的基因功能和KEGG通路;用Autodock和PyMol进行分子对接,验证核心活性成分与核心靶点蛋白的相互作用。结果显示:青黛复方制剂含有330种化合物,其中有效活性成分为62种,主要的活性物质有β-谷甾醇、豆甾醇、常春藤皂苷元、山柰酚、异牡荆素等10种;有效活性成分作用于64个猪免疫相关基因以及SLC6A4、ESR1、TNF等20种核心靶蛋白,通过IL-17信号通路、TNF信号传导途径、NOD样受体信号传导途径等调节天然免疫和特异性免疫系统功能,提高香猪的抵抗力。青黛复方制剂主要通过β-谷甾醇、异牡荆素等主要活性成分,影响白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(IFN-α)、干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平。分子对接分析表明,这些活性成分能够与靶蛋白有效结合,可为中药增强机体免疫力的物质基础和作用机制等研究提供参考。同时,网络药理学分析结果可为全面解析青黛复方制剂增强猪免疫力的作用机制提供依据。

11种肉及肉制品动物源性成分PCR检测技术

为建立准确的动物源肉制品检测技术,采用生物信息学方法,针对猪、牛、马、山羊、小鼠、大鼠、兔、犬、鸡、鸭、鹅等11种动物肉类的特异性基因,建立了特异性PCR检测技术。该技术可高特异性检测猪、牛、马、山羊、兔、犬、鸡、鸭、鹅源肉样,并可鉴别掺入的大鼠、小鼠等违禁肉类成份,最低检测限为1.00 ng/μL基因组DNA,以及低至1%的肉类添加量。运用该技术在市场中随机抽检3种初加工肉制品各10份进行验证,结果在每种肉制品中均检出掺假样品,不同种类肉品的掺假率为10%~20%。本研究建立了具有高灵敏、准确、低成本、适用范围广等优势的肉制品动物源性成份检测技术,为消费市场肉制品质量检测提供了技术支撑。

贵州猪、牛志贺样毒素大肠杆菌的检出与鉴定

以两对合成的寡核苷酸引物 ,通过聚合酶链式反应 ,检测 158份猪和牛腹泻粪便分离物 ,从 8份猪源和 3份牛源分离物中扩增出大肠杆菌志贺样毒素基因片段 ,其生化试验符合大肠杆菌特征 ,经Vero细胞检测均产生志贺样毒素 ,血清学试验证实分属不同的血清型 。

猪大肠杆菌热敏肠毒素B亚基基因的克隆及高效表达

本文以多聚酶链反应扩增得到的ＬＴＢ基因ＤＮＡ片段为探针，克隆了含猪源大肠杆菌ＬＴＢ基因的７７５ｂｐＨｉｎｄⅢ酶切片段，对插入片段进行了核苷酸序列测定：将含ＬＴＢ基因的ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切片段插入表达载体ｐＫＫ２２３－３中得到亚克隆ｐＲＸ－ＬＴＢ，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ分析，ｐＲＸ－ＬＴＢ转入大肠杆菌ＪＭ１０７细胞中，在ＩＰＴＧ诱导下，ＬＴＢ基因得到高效表达，其表达量为亲本菌株的３２倍。

猪大肠杆菌热敏肠毒素A亚基基因的克隆及核苷酸序列分析

本文克隆了含猪源肠毒素大肠杆菌ＬＴＡ基因的６．７ｋｂＥｃｏＲＩ酶切片段，进行了限制酶图谱分析和核苷酸序列测定，共测定了１０９３ｂｐ的核苷酸序列，其中ＬＴＡ亚基基因编码区长７６５ｂｐ，编码２５４个氨基酸的蛋白质；计算分子量为２９６５２；氨基酸组成表明，ＬＴＡ富含带电荷的精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，同时酪氨酸和苯丙氨酸也异常的高。

应用聚合酶链反应检测食品中肠毒素大肠杆菌

应用聚合酶链反应（PCR）对食品样品中肠毒素大肠杆菌（ETEC）热敏性肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）基因进行扩增，两对引物从ETEC的LT和ST基因中分别扩增出314bP和237bP的DNA片段，均能与相应的LT和ST基因探针杂交；酶切分析表明，不同菌株扩增的片段为均一的LT基因和ST基因的PCR产物；对128份食品样品中ETEC的污染情况进行了测定，三种基因型（LT，ST，LTST）的ETEC从样品中鉴定出。

猪源大肠杆菌耐热肠毒素基因的分子克隆

以ＰＣＲ方法克隆得到猪源大肠杆菌ＳＴ１基因缺失ＣｏｏＨ端最后两个编码密码和终止密码的ＤＮＡ片段，并以该片段为探针，筛选了以载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ构建的猪大肠杆菌Ｐ５５质粒ＤＮＡ文库，得到插入片段约５．５ｋｂ阳性克隆，亚克隆了约０．５ｋｂ含ＳＴ基因的ＴａｑⅠ酶切片段，并对该基因核苷酸序列进行了分析。应用竞争性ＥＬＩＳＡ测定了ＳＴ基因在不同启动子调控下的表达情况，在Ｔ７启动子调控下。

应用复合引物扩增大肠杆菌肠毒素基因的研究

以两对合成的不同寡核苷酸引物通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、扩增肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）不耐热肠毒素（ＬＴ）和耐热肠毒素（ＳＴ）基因；两对引物从ＥＴＥＣＬＴ和ＳＴ基因中分别扩增出３１４ｂｐ，２３７ｂｐ的ＤＮＡ片段，均能与相应的ＬＴ和ＳＴ基因探针杂交。ＬＴ扩增产物（３１４ｂｐ）和ＳＴ扩增产物（２３７ｂｐ）分别和ＳｍａⅠ和ＨｉｎｃⅡ酶切后，产生１９０ｂｐ和１２４ｂｐ，１４７ｂｐ和９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。同一扩增反应中应用ＬＴ和ＳＴ复合引物进行扩增，３种基因型ＬＴ、ＳＴ和ＬＴＳＴＥＴＥＣ从样品中鉴定出。１０９份动物腹泻粪样分别用ＰＣＲ，核酸杂交和ＥＬＩＳＡ进行测定，结果表明，ＰＣＲ是最为灵敏和快速的测定ＥＴＥＣ的方法。

应用聚合酶链反应技术克隆猪源大肠杆菌耐热肠毒素基因

以质粒ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增和克隆了猪大肠杆菌耐热毒素基因ＤＮＡ片段；核苷酸序列分析表明。

轮状病毒的生物素核酸探针及分子杂交的研究

用亚硫酸氢钠-乙二胺溶液对轮状病毒的ssRNA胞嘧啶修饰和转氨基作用,与生物素e-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应,制备探针与结合在硝基纤维膜上的核酸样品杂交,然后用亲和素和生物素化碱性磷酸酶温育,2-萘酚磷酸和固蓝B盐显色,阳性反应呈蓝紫色;轮状病毒生物素核酸探针可检测20～39pgRNA靶序列。SA_(11)或NCDV探针可识别同源的SA_(11)和NCDV核酸序列,也能识别同属A群的Wa株,羊轮状病毒S_1株的核酸序列。检测141份猪、羊和人腹泻粪样,杂交阳性118份,并对几株细胞培养物进行了杂交试验。结果表明,该法制备的生物素探针具有稳定、特异、灵敏等特点,较其他化学方法制备生物素探针简单,取材容易,价廉,可以广泛应用于各种微生物的基础研究及其所致疾病的临床诊断。

体外转录制备轮状病毒生物素核酸探针

通过体外转录将生物素化UTP掺入到轮状病毒的单链RNA中制成探针,把它与结合在硝基纤维膜上的核酸样品杂交,经亲和素一生物素化碱性磷酸酶温育,α-萘酚磷酸和固蓝盐显色后,阳性反应呈蓝紫色;轮状病毒生物素核酸探针可检测到20PgRNA靶序列。SA_(11)或NCDV探针可识别同源的SA_(11)、NCDV、Wa和Sl的核酸序列。检测141份猪、羊和人腹泻粪样,118份呈阳性。对几株细胞培养物进行了杂交试验。结果表明,生物素核酸探针具有稳定、特异。

猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素基因的融合及表达

用聚合酶链反应扩增出猪源大肠杆菌编码ST前体 (pro ST)和LT的B亚单位 (LTB)成熟多肽的序列 ,再通过套式PCR将pro ST编码序列 3′端和LTB编码序列 5′端融合 ,并置于同一阅读框内 ,得到ST和LTB的融合基因 ,将此序列克隆到pGEM T质粒中 ,序列分析后 ,亚克隆到表达载体pQE30中 ,在大肠杆菌细胞中得到表达 ,表达的融合蛋白同时具有ST和LTB的抗原性 ,且无ST和LT的生物毒性。

聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素基因

两对寡核苷酸引物通过聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素Ｉ（ＳＬＴ Ｉ）和志贺样毒素Ⅱ（ＳＬＴⅡ）基因，在单一反应中，两对引物分别扩增出１３０ｂｐ（ＳＬＴⅠ）和３４６ｂｐ（ＳＬＴ Ⅱ）的ＤＮＡ 片段，扩增片段经地高辛标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交分析，证实为ＳＬＴ Ⅰ和ＳＬＴ Ⅱ基因产物。同一扩增反应中应用ＳＬＴⅠ和ＳＬＴⅡ复合引物进行扩增，不同基因型志贺样毒素大肠杆菌从样品中鉴定出。８６９份牛、猪腹泻粪样ＤＮＡ 样品通过ＰＣＲ进行了测定，其中，３％ 检出志贺样毒素大肠杆菌，与牛出血性腹泻、猪水肿病有关。

畜禽分子育种技术研究进展及趋势

简要介绍了畜禽分子育种技术的背景、现状、趋势。阐述了分子育种技术在动物性状改造方面的应用范例,对各应用领域的进展进行了简略回顾,同时指出了分子育种技术在动物种业领域的主要任务和发展重点、对策措施与政策建议。

热磁分析仪的试制及应用

我们研制的热磁分析由法拉第(Faraday)磁极、电子天平、石英反应器及自动记录装置四部分组成,对磁化率在±1×10^(-7)～1×10^(-1)emu/g的物质(几乎所有的催化剂)皆能进行磁学分析。通过对CuSO_4·_5H_2O磁化率测定Ni粉及Fe居里温度测定表明分析结果可靠;利用该热磁分析仪,对Fe—Mo催化剂的煅烧过程,Fe—Cr高变催化剂耐热性能进行了研究。同时还测定了Ni催化剂在各种还原状态下的还原度,表明该热磁分析仪可以用于研究催化剂在反应、还原、煅烧等过程的价态和相的变化历程。