规模化奶牛养殖场布鲁氏菌病血清学调查

为了对中国奶牛群进行布鲁氏菌病的血清学调查,实验室拟定采用虎红平板凝集试验进行调查,自2011年1月—2013年6月,实验室收到送检和采集的全国范围内的规模化奶牛养殖场血样样本进行虎红平板凝集实验,对养殖场大群和流产奶牛进行初步的筛查。结果表明:虎红检测奶牛血清样本共计5575份,阳性血清1036份,占检测样本总数的18.58%。其中,群检奶牛血清样本4980份,阳性样本792份,虎红阳性率为15.90%;流产奶牛血清样本595份,阳性样本244份,虎红阳性率为41.01%。结果显示:全国范围内,布鲁氏菌病的发病情况比较严重,而且范围很广,呈现上升趋势,布鲁氏菌病引起的奶牛流产,在各种流产因素中占据很大比例。

山东省规模化奶牛场结核病与副结核病流行病学调查研究

近年来,随着中国奶业的快速发展,奶牛结核与副结核病越来越严重地威胁到行业的健康发展,牛结核与副结核病的防控也日益受到重视。缺乏牛结核与副结核病流行病学数据及有效的疫苗是中国控制牛结核与副结核病的最大障碍。由此本试验利用牛型提纯结核菌素、提纯副结核菌素对牛群进行皮内变态反应试验,筛选出阳性牛和可疑牛,以进一步开展γ-干扰素释放试验,从而对山东省规模化奶牛场逐步开展分子流行病学调查。2010-2012年共随机抽检了山东省不同地区的1678头样本。结果表明,牛结核与副结核病的阳性率从2010年的35.42%和29.34%下降至2012年的25%和14.93%。这说明,通过系统的监测及无害化处理阳性牛、隔离可疑牛等措施能够使牛群结核与副结核病逐步得到控制,进而实现净化。

不同激素组合对山东白山羊同期发情的比较研究

以山东白山羊为研究对象,应用国产的孕酮阴道海绵栓,结合PMSG/FSH、PG和HCG,将78头受体羊随机分为4组进行同期发情及卵巢排卵研究。结果显示:放栓15 d,同时在去栓前3 d肌注400 IU/只PMSG和去栓前1 d肌注0.1 mg/只PG,鉴定发情后再肌注100 IU/只HCG处理方案效果最好,发情率为84.21%,黄体形成率为75%。同时手术检查卵巢卵泡和黄体形成情况,处理方案中放栓15 d+PMSG+PG+HCG组卵巢上均有多个排卵黄体,并且排卵窝比较明显。该研究所优化的方案为获得高质量的转基因胚胎移植受体羊提供了技术支持。

2017-2018年山东省奶牛场犊牛腹泻相关病毒病原学检测

为了解山东省奶牛养殖场中引起犊牛腹泻相关病毒的流行情况,2017-2018年,在全省13个地区51家规模化奶牛养殖场,采集624份犊牛腹泻病料样品,进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒(BCo V)和牛轮状病毒(BRV)PCR检测,并对检测结果采用SPSS 20.0软件进行数据统计以及显著性差异分析(Pearson卡方检验)。结果显示:BVDV、BEV、BCo V、BRV个体检出率分别为34.58%、11.78%、8.84%、17.70%,群体检出率分别为47.83%、38.89%、35.71%、33.33%,BVDV检出率显著高于其他3种病毒(P<0.01),且有流行加重趋势;鲁西北、鲁中、鲁西南、半岛地区4种病毒的检出率有差异,其中鲁中地区的BVDV检出率明显高于其他地区(P<0.01)。结果表明,BVDV、BEV、BCo V、BRV 4种病原在山东省奶牛场中流行广泛,以BVDV流行最为严重,尤其是鲁中地区,且有流行加重趋势,成为导致奶牛场犊牛腹泻的主要病毒性因素,建议有针对性地开展防控与净化。本检测初步摸清了山东省不同地区引起奶牛犊牛腹泻相关病毒的感染情况,可为山东省制定奶牛腹泻病综合防控措施提供数据支撑。

三种血清学布鲁氏菌检测方法在不同疫苗免疫奶牛中的比较

布鲁氏菌病是一种世界范围内广泛分布的严重人畜共患病。疫苗免疫和血清学诊断是有效控制和净化该病的两种重要措施,但疫苗免疫对血清学诊断存在较大影响。因此,弄清楚不同疫苗免疫在不同检测方法下的抗体消减规律显得尤为重要。本研究选取15头6月龄健康母牛,随机分为5个试验组,每组3头,分别为600亿单位A19疫苗注射组、600亿单位A19疫苗口服组、500亿单位S2疫苗口服组、500亿单位S2疫苗注射组和对照组。对不同组试验牛进行隔离饲养,免疫完成后进行一次带牛环境消毒。免疫完成后每月采集牛血制备血清保存,连续采集6个月,分别使用RBPT(虎红平板凝集实验)、iELISA、cELISA进行检测。结果表明,相比口服免疫方式,注射免疫方式的疫苗抗体峰值水平更高,抗体持续时间更长;注射免疫方式下,S2疫苗的抗体峰值水平高于A19苗,但抗体持续时间较短;口服免疫A19疫苗,6个月内三种方法均未检测到抗体。可见,疫苗免疫对布鲁氏菌病血清学诊断有明显的干扰作用,但对cELISA检测的影响时间较短,采用cELISA可有效区分疫苗免疫和野毒感染。针对不同免疫方式的不同疫苗,应选择合适的时间节点。

奶牛产气荚膜梭菌的分离鉴定与药物敏感性分析

本研究旨在对从奶牛内脏、组织病料样品中分离得到产气荚膜梭菌并进行鉴定分型,为后续疫苗研究提供材料,并通过药敏试验筛选出较为敏感的药物以针对性的指导牧场对牛群进行治疗并提出有效的防治隔离建议。2019年山东21家牧场部分奶牛出现腹泻、便血及短期内死亡等现象,对部分死亡奶牛进行剖检,并送检64份内脏、组织病料样品进行CP培养初筛,对初筛阳性菌株用生化鉴定及PCR分型鉴定;以16S rDNA技术对CP菌株进行同源性分析;采用E-test法测定分离菌对7种抗菌药物(红霉素、左氟沙星、利奈唑胺、万古霉素、克林霉素、四环素、利福平)的最低抑菌浓度(micro inhibition concentration,MIC),筛选出敏感药物。8份样品血琼脂培养基细菌培养出现灰白色菌落,梭菌显色培养基培养为橘红色梭菌典型特征菌落;生化鉴定结果符合产气荚膜梭菌特征;PCR分型结果显示5株为A型、2株C型和1株E型;16S rDNA分析得出8株分离菌与产气荚膜梭菌同源性最高可达100%;8株CP菌株对7种药物敏感,其中2株对克林霉素、利福平更为敏感,3株对红霉素及利奈唑胺敏感,1株对左氟沙星更敏感。对有病牛的2家牧场推荐使用林可酰胺类、利福霉素类及大环内酯类药物进行防治,对牧场防治效果及时追踪,对于没有治疗价值的牛立即扑杀,无害化处理,改善饲养条件,减小饲养密度。

副结核分支杆菌MAP0862蛋白的表达及临床应用

本研究以腹泻牛粪便基因组DNA为模板,扩增MAP0862基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862,通过原核表达系统表达His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白,经纯化后制备兔源高免血清,建立ELISA特异性检测方法,最后将纯化蛋白和ELISA方法用于牛副结核病临床样品检测,并对检测数据进行分析。结果表明,以MAP0862蛋白为检测原建立的ELISA检测方法在临床样品检测中具有较高的特异性和敏感性,说明MAP0862蛋白适用于副结核病抗体检测。本研究建立的ELISA检测方法可有效检测临床样品中副结核病的感染。

牛分枝杆菌esat6和cfp10蛋白的表达及在临床检测中的应用

本研究以牛分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,扩增esat6和cfp10基因,构建重组表达载体p ET-32a(+)-esat6和p ET-32a(+)-cfp10,并通过原核表达系统分别表达重组esat6和cfp10蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化后,对目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot验证,BCA法测定目的蛋白浓度,最后将east6和cfp10蛋白混合后用于牛结核病临床检测,并对检测数据进行分析。结果表明,牛分枝杆菌esat6和cfp10蛋白在大肠杆菌系统中获得高效表达;其混合蛋白应用于结核病检测具有较高的特异性,且在皮肤变态反应和IFN-γ释放试验两种检测方法中具有较高的符合率。说明相较于提纯结核菌素(PPD),esat6和cfp10混合蛋白具有较高的特异性和稳定性,将有希望替代PPD用于牛结核病检测。

一种新的牛支原体膜蛋白p59的表达与鉴定

目的寻找新的牛支原体(Mycoplasma bovis)抗原蛋白并进行原核表达,为牛支原体疫苗的制备奠定基础。方法采用生物信息学方法分析牛支原体PG45株基因组,发现一种新的膜蛋白p59,并对其理化性质、蛋白定位、是否存在信号肽及其互作蛋白进行分析预测。通过PCR扩增p59蛋白编码基因,经酶切连接表达载体pET-30a(+)后转化入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达并进行优化,利用不同浓度咪唑洗脱液来洗脱蛋白。通过Western blot进行鉴定。制备p59重组蛋白兔多抗,通过粘附试验和支原体生长抑制试验验证该重组蛋白的功能。结果生物信息学分析该蛋白可能为ABC转运系统的组成蛋白,其互作蛋白为糖、微量元素摄取的ABC转运系统相关蛋白,可能参与牛支原体摄入营养物质的过程。PCR扩增p59基因,双酶切及测序鉴定pET-30a(+)-p59原核表达载体构建正确,SDS-PAGE分析重组载体转化BL21表达p59重组蛋白,相对分子质量为66×10^3。Western blot鉴定该蛋白为膜蛋白,免疫新西兰兔可刺激产生特异性抗体,即具有抗原性。p59蛋白粘附MDBK细胞试验显示,用p59兔多抗作为一抗时的MDBK(Madin-Darby bovinekidney,牛肾细胞)细胞表面能够粘附更多的P59蛋白,表明p59重组蛋白具有一定的粘附能力。生长抑制试验表明,p59兔多抗能抑制牛支原体在固体培养基中的生长,生长抑制率为45.53%。结论新鉴定的牛支原体膜蛋白p59可能是一种粘附相关蛋白,且具有抗原性,该蛋白多抗血清能抑制支原体的生长,为研究支原体膜蛋白的功能奠定了基础,为牛支原体亚单位疫苗的研制提供了新的靶蛋白。