脊髓损伤患者血浆外泌体蛋白分子标志物的筛选研究

目的应用蛋白质非标记定量技术和生物信息学分析筛查脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)患者血浆外泌体蛋白分子标志物。方法收集2021年1月至2022年6月南京医科大学第一附属医院SCI患者及健康对照人群血浆标本各50份。使用超速离心法分离血浆外泌体,通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和Western blot对外泌体进行鉴定。利用Label-Free定量蛋白质组学分析血浆外泌体差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs),并基于基因本体(Gene Ontology,GO)和基因功能和基因组信息(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库对DEPs进行表征、注释和富集分析。利用血浆外泌体标本对筛选出的DEPs进行Western blot和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)验证。结果根据美国脊柱损伤协会脊髓损伤分级:A级14例、B级19例、C级12例、D级5例。SCI患者的血浆外泌体与对照组外泌体均呈现典型的杯状形态,直径30~200 nm。经蛋白质非标记定量技术共鉴定出493种外泌体蛋白,筛选出126种蛋白质差异表达,其中38种上调、88种下调。GO注释显示了DEPs主要参与蛋白质激活级联、补体激活和免疫反应等功能。KEGG富集分析显示了DEPs参与补体和凝血级联反应、蛋白酶体和神经退行性疾病通路等生物学途径。根据蛋白质组学和生物信息学分析初步筛选出2个候选蛋白:APOB和S100A9。Western blot结果显示30份SCI患者血浆外泌体中S100A9蛋白相对表达量(1.62±0.19)较30份对照组(0.86±0.24)升高,差异有统计学意义(t=8.55,P<0.001),而APOB蛋白相对表达量(1.06±0.13和1.02±0.23)比较差异无统计学意义(t=0.46,P=0.653)。ELISA试验结果显示S100A9在不同程度SCI患者血浆外泌体中表达[A级(197.7±11.7)pg/ml、B级(151.7±15.2)pg/ml、C级(136.3±14.7)pg/ml]差异有统计学意义(F=69.94,P<0.001),SCI严重程度越高,S100A9在血浆外泌体中的表达越高(A级与B级,q=13.11,P<0.001;A级与C级,q=15.66,P<0.001;B级与C级,q=4.19,P=0.005)。结论S100A9是评估SCI严重程度的潜在有效血浆外泌体分子标志物。