山梨糖脱氢酶基因在酮古龙酸菌中的过表达

目的在酮古龙酸菌中克隆并过表达山梨糖脱氢酶基因,以便提高单菌发酵产2-酮基-L-古龙酸的能力。方法从酮古龙酸菌DSM4025基因组中克隆获得山梨糖脱氢酶基因(sorbose dehydrogenase,sdh),酶切连接到含有双亲本接合转移关键基因即可移动基因(mobilization,mob)的p BBR1MCS-2质粒上,构建p BBR1MCS-2-sdh重组质粒;再将p BBR1MCS-2、p BBR1MCS-2-sdh分别转入供体菌大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)S17-1中,以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)Rif-B-003为受体菌进行双亲本接合转移。挑取利福霉素(Rifamycin,Rif)和卡那霉素双抗平板上的接合子进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、双酶切和测序验证。取重组菌进行摇瓶发酵,用菌体蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳结果来验证阳性克隆的过表达成功,并检测发酵终点2-酮基-L-古龙酸的产量。结果构建的重组质粒p BBR1MCS-2-sdh成功转入酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)Rif-B-003中,SDS-PAGE检测到,发酵终点菌体蛋白在58 ku(目标蛋白)处条带有加深,重组菌株发酵终点2-酮基-L-古龙酸产量相比于对照菌株酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)Rif-B-003提高了20.86%。结论山梨糖脱氢酶基因在酮古龙酸菌Rif-B-003里过表达成功,可以提高发酵终点2-酮基-L-古龙酸的产量。