溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌

目的建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS BiofloⅣ20L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化。结果保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2mmol/LIPTG诱导5h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺。

人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测

目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。

碱性MAGE家族新成员restin在大肠杆菌中的表达和抗体制备

目的:从维甲酸诱导的白血病细胞系HL60中,克隆编码219个氨基酸的新基因restin,构建原核表达载体、制备抗血清并进行初步应用。方法:采用PCR技术,以维甲酸诱导的白血病细胞的cDNA为模板,扩增出restin的编码区。将其克隆入大肠杆菌表达载体中。经过温度诱导获得restin表达蛋白。利用SDS-PAGE纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备该蛋白的抗血清。以该抗体做间接免疫荧光,初步观察restin在COS-7细胞内的表达分布。结果:大肠杆菌中表达的restin蛋白的Mr为26000。将其初步纯化后免疫新西兰白兔制备的抗血清,用Westernblot检测其效价为1∶800。间接免疫荧光显示,restin蛋白主要分布在细胞核内。结论:成功地制备抗restin的抗体,为进一步研究restin蛋白在组织中的表达、细胞内亚定位以及信号转导通路提供了前提条件。

重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵及其免疫学活性

目的:实现重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵,并测定MAGE3/HSP70融合蛋白在体内的抗肿瘤免疫效应.方法:利用自控发酵罐发酵,采用溶氧反馈,分批补料的方法对MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌进行了高密度发酵,从菌体中纯化MAGE3/HSP70融合蛋白,并用所纯化的MAGE3/HSP70融合蛋白免疫小鼠,运用酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测了融合蛋白激活机体细胞免疫反应的状况.结果:高密度发酵取得成功,发酵菌中MAGE3/HSP70融合蛋白的表达量与摇瓶中的相当,摸索出发酵水平纯化MAGE3/HSP70融合蛋白工艺,ELISPOT和LDH显示MAGE3/HSP70可以激活机体免疫反应,并产生针对MAGE3的CTL,特异性杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞.结论:MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌成功实现高密度发酵,MAGE3/HSP70融合蛋白可以有效激活机体免疫反应,产生针对特异性抗原MAGE3的CTL,免疫学活性良好,为新型抗肿瘤疫苗临床前研究奠定了良好基础.

利用Jurkat细胞增殖法建立胸腺肽活性的检测方法

目的:利用Jurkat细胞增殖法建立胸腺肽活性的检测方法,并进行优化、验证。方法:培养Jurkat细胞,加入不同浓度的胸腺肽制剂分别刺激24 h或48 h,然后通过细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测Jurkat细胞的增殖水平。同时,并对利用Jurkat细胞增殖法检测胸腺肽活性的方法的专属性、重复性、灵敏度、精密度及适用性进行验证。结果:最佳检测条件:胸腺肽使用浓度范围为20~200μg/mL;刺激时间为24 h;CCK-8染液孵育时间为3 h。胸腺肽活性在20~200μg/mL范围内,增殖相对提高率具有一定的浓度依赖性;重复性验证RSD均小于15%;Jurkat细胞增殖法检测破坏后的胸腺肽活性显著降低,且与E-玫瑰花环法检测的胸腺肽活性结果呈正相关关系(r=0.75,P<0.05)。结论:基于Jurkat细胞增殖法检测胸腺肽活性的方法具有准确客观、灵敏和稳定等优点,能够满足胸腺肽活性检测要求,可进一步推广。

改良的Tricine—SDS—PAGE电泳检测胸腺肽分子量

目的建立一种分析胸腺肽制剂中多肽分子量分布的简便可行的方法。方法采用改良的Tricine-SD-PAGE电泳方法分析胸腺肽制剂中多肽的分子量分布，并分析其中胸腺素α1的含量。结果采用该法可检出1μg的胸腺肽α1，分析国内市场上的胸腺肽制剂多肽分子量分布范围在3．5～8．5kD。结论该法适用于分析胸腺肽制剂中多肽组分的分子量分布和胸腺肽α1的存在，可用于胸腺肽制剂的质量控制。

胸腺肽高分子量物质检测方法的优化

目的优化现行胸腺肽质量标准中控制高分子量(Mw)物质的检测方法,解决该方法存在的对照品Mw大小与洗脱时间矛盾的问题。方法采用高效液相凝胶过滤色谱法(HPGFC),改变流动相的组成,建立高Mw物质的分析方法,并进行方法学验证。结果确定三氟乙酸-乙腈-水(0.05∶45∶55)作为流动相的HPGFC分析方法,在该洗脱条件下,对照品的洗脱顺序符合Mw变化的规律,经过方法学验证,改进后的方法更适于检测高Mw物质的含量。结论优化后的高Mw物质检测方法可用于胸腺肽制剂的质量控制,并为其他生化制剂高Mw蛋白检测提供了方法学参考。

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b(+)原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。

经桡动脉途径行冠心病介入治疗

目的 :探讨经桡动脉行冠心病介入治疗的安全性及临床疗效。方法 :选择Allen’s试验阴性的住院冠心病病人 3 1例接受经桡动脉介入治疗。结果 :共植入支架 42枚。经桡动脉介入成功 3 0例 ,成功率 96.8% ,术后平均住院日( 2 .7± 0 .7)天。 1例出现桡动脉痉挛 ,改用股动脉途径行介入治疗后成功。治疗病例无死亡 ,1例出现前臂血肿 ,未行特殊处理痊愈。结论 :只要患者适应证选择得当 ,操作规范 ,经桡动脉途径行冠心病介入治疗是安全、可行的。

脑蛋白水解物的提取工艺优化

目的:优化脑蛋白水解物的提取工艺。方法:以p H约为9的碱性提取液进行提取;以总氮含量、与脑蛋白水解物(丽珠赛乐)肽图的相似度的综合评分为指标,通过L9(34)正交试验优化猪脑(1 kg)水解工艺中胰蛋白酶的加入量、胃蛋白酶的加入量及水解时间,并进行工艺验证试验。结果:最优提取工艺为胰蛋白酶加入量8 g、胃蛋白酶加入量5 g、水解时间12 h;验证试验中所制脑蛋白水解物的总氮含量分别为5.20、5.18、5.20 mg/ml(RSD=2.22%,n=3),肽图相似度分别为93%、94%、96%(RSD=1.62%,n=3),综合评分分别为0.911、0.917、0.932(RSD=1.18%,n=3)。结论:优化的生产工艺合理、提取效率高,产物肽图相似度高。

血液灌流联合血液透析滤过对甲状旁腺素清除效果的观察

血液透析滤过是采用弥散与对流的方式清除血液中小分子毒素.血液灌流通过吸附作用来清除尿毒症患者的中分子毒素.本研究在规律血液透析基础上分别采用血液透析滤过、血液灌流联合血液透析滤过2种治疗方式,观察尿毒症患者血清甲状旁腺素的清除情况及皮肤瘙痒、骨痛、食欲减退、睡眠障碍、不安腿综合征的改善情况.

柱前衍生法测定胸腺中组胺的含量

目的建立一种科学、合理的检测胸腺中组胺含量的方法，用于控制胸腺原料的质量。方法采用丹磺酰氯柱前衍生，HPLC-UV法，C18（4．6mm×250mm，5μm）色谱柱，乙腈-水为流动相，流速1．0mL·min-1,检测波长254nm，梯度洗脱。结果采用本方法测定组胺标准品，在1．0～50μg·mL-1的范围内，组胺的浓度与峰面积成线性相关，相关系数为0．9979，加样回收率85％～110％，RSD％〈10％。结论采用该方法测定胸腺中痕量组胺的含量，具有简单、快速、准确、灵敏，重复性好的特点，可以用于胸腺原料的质量控制。

终末期肾病临床路径变异原因分析

开展临床路径管理是深化医药卫生体制改革、推动医疗质量持续改进,规范临床诊疗行为的需要。临床路径（Clinical Pathway,CP）是由医师、临床医学专家、护士以及医院管理者等参与的,根据某种疾病或手术制定的一种医护人员共同认可的诊疗模式[1]。临床路径有严格的工作顺序、准确的时间要求,其目，

高三尖杉酯碱及其制剂有关物质的研究

目的：建立RP-HPLC测定高三尖杉酯碱及其制剂有关物质的方法，并用其分析不同处理后高三尖杉酯碱有关物质的量。方法采用Germsil-PC18色谱柱（250×4.6mm，5μm），以10mmol·L-1磷酸二氢钾溶液为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速1mL·min-1，检测波长288nm，柱温30℃。结果高三尖杉酯碱在2-30μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9996；以高三尖杉酯碱进样量为20μg重复进样6次，杂质A、杂质B、高三尖杉酯碱的RSD分别为3.28%，4.69%，1.12%。结论应用本方法精确可以测定高三尖杉酯碱中杂质A、杂质B等有关物质的量及高三尖杉酯碱的含量。

原发性肝细胞癌的细针穿刺细胞学诊断

目的 :对 3 8例原发性肝细胞癌进行细针穿刺细胞学检查 ,并分析细胞形态学特点 ,以提出诊断意见。方法 :超声波引导下行肝脏细针穿刺针吸细胞学诊断原发性肝细胞癌。结果 :原发性肝细胞癌进行细针吸取细胞学检查 ,其细胞形态学有一定的特点 ,与组织学有一定可比性。结论 :细针穿刺细胞学检查对原发性肝细胞癌的诊断是准确的 ,是早期诊断的重要方法之一 。

森林脑炎病人心电图改变(附229例分析)

目的 :探讨森林脑炎病人心血管及心电图变化。方法 :选择分析 2 2 9例林林脑炎中 74例心ECG的明显变化 ,近而观察心血管系统的受累情况。结果 :窦性心动过缓 30例 ;窦性心动过速 4例 ;ST级下移、T波低平侧置 2 4例 ;QRS丛低电压 2例 ;左室肥厚 6例 ;左右束阻分别为 2例、4例 ;房早和Ⅰ°房室阻滞各 1例。结论 :森林脑炎病毒可侵犯心血管系统 ,主要抑制心肌细胞传导功能 。

213例恶性浆膜腔积液细胞学临床病理分析

目的 :探讨恶性浆膜腔积液临床病理学特征。方法 :对 2 13例恶性浆膜腔积液进行细胞病理学观察与分析 ,并结合临床资料、病理形态及鉴别诊断。结果与结论 :恶性浆膜腔积液是一种常见的临床病症 ,可来源于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌 。

干燥综合征并横纹肌溶解综合征1例

患者,女,76岁,主因发热、咳嗽、周身乏力6天于2011年2月6日入院。患者于入院前6天受凉后出现发热（体温不详）、咳嗽、咳黄色痰,周身乏力,于某诊所静点头孢哌酮钠3.0mg/d,共3日,病情无明显缓解,遂入我院。