一种用于图像分类的多视觉短语学习方法

针对词袋图像表示模型的语义区分性和描述能力有限的问题,以及由于传统的基于词袋模型的分类方法性能容易受到图像中背景、遮挡等因素影响的问题,本文提出了一种用于图像分类的多视觉短语学习方法.通过构建具有语义区分性和空间相关性的视觉短语取代视觉单词,以改善图像的词袋模型表示的准确性.在此基础上,结合多示例学习思想,提出一种多视觉短语学习方法,使最终的分类模型能反映图像类别的区域特性.在一些标准测试集合如Caltech-101[1]和Scene-15[2]上的实验结果验证了本文所提方法的有效性,分类性能分别相对提高了约9%和7%.

山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组序列分析

为了解目前我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株基因组特征,本实验室于2020年从山东某养殖集团不同场区采集7份疑似感染PRRSV的组织样品,进行RT-PCR检测,将阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAM)分离病毒,利用间接免疫荧光试验(IFA)对分离病毒进行鉴定,经PCR对分离株全基因组序列分段扩增,采用生物信息学软件对分离株的ORF5基因及全基因组序列的同源性、NSP2氨基酸序列缺失特征和ORF5氨基酸变异位点及糖基化位点、ORF5基因与全因因组遗传演化关系分析以及全基因组的重组分析。结果显示:7份组织样品均呈PRRSV阳性,其中有6份阳性样品接种猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)后产生细胞病变,且通过荧光显微镜可观察到特异性绿色荧光,表明分离到6株PRRSV;对6株PRRSV的全基因组序列扩增、测序、拼接,通过全基因组序列同源性对比发现6株PRRSV全基因序列之间的同源性约99.4%~100%,表明6株PRRSV是同一来源,选择其中1株(SDlz0720株)进行后续分析。序列分析结果显示:SDlz0720株NSP2氨基酸序列均具有“111+1+19aa”的缺失特征,与NADC30-like PRRSV NSP2氨基酸序列缺失特征一致;ORF5氨基酸序列同其他谱系对比在诱骗表位区域、高变区均发生了氨基酸的突变。ORF5基因进化树结果显示,SDlz0720株位于类NADC34-like PRRSV分支,而全基因组进化树结果显示SDlz0720株位于NADC30-like PRRSV分支,属于Sublineage1.8。重组分析结果显示,该株病毒是由NADC30-like PRRSV与HP-PRRSV和NADC34-like PRRSV重组产生。上述结果表明目前我国PRRSV流行株类型多样,美国输入性病毒株与我国本土病毒株发生了复杂的重组现象。本研究通过对PRRSV的分离鉴定与遗传进化分析为PRRSV分子流行病学研究提供了数据支持。

Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效果比较

为了比较不同抗原含量的Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白亚单位疫苗与全病毒灭活疫苗的免疫效力差异,本研究制备不同抗原含量的亚单位疫苗和全病毒灭活疫苗,采用超低免疫剂量20μL/只免疫SPF鸡,免疫21 d后攻毒,通过死亡率、临床症状、大体剖检病变、免疫组化和泄殖腔拭子排毒等进行免疫效力比较。试验结果表明,亚单位疫苗抗原含量AGP效价不低于1∶8,全病毒灭活疫苗抗原含量为10^(7.0)TCID_(50)/0.1 mL时,可抵抗Ⅰ群禽腺病毒(4型)强毒株的攻击,提供100%的免疫攻毒保护,攻毒后3、5、7 d泄殖腔拭子均未见排毒,且免疫组化均为阴性。亚单位疫苗抗原含量AGP效价为1∶4,全病毒灭活疫苗抗原含量为106.5 TCID_(50)/0.1 mL时,在超低免疫剂量情况下,仍可提供至少80%的免疫攻毒保护,且攻毒后3、5、7 d泄殖腔拭子排毒率仅为2/10~3/10,免疫组化阳性率仅为1/10。但全病毒灭活疫苗抗原含量为106.0 TCID_(50)/0.1 mL时,免疫攻毒保护效果不理想。综合以上结果表明,Fiber-2蛋白具有良好的免疫原性,抗原含量AGP效价不低于1∶4,与全病毒灭活疫苗抗原含量为106.5 TCID_(50)/0.1 mL免疫效力相当,可用于疫苗研制开发。

非洲猪瘟病毒MGF360蛋白原核表达质粒的构建及其蛋白表达与纯化

为了提供有效的抗原蛋白用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的临床诊断及防控研究,试验对ASFV SY-18株的多基因家族(MGF360)中的9L^14L共计6条基因序列进行E.coli密码子优化,合成优化后的基因序列并克隆至pET28a质粒上,然后转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白。结果表明:MGF360蛋白的原核表达质粒构建正确,无点突变。MGF360蛋白的原核表达质粒成功转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经诱导表达的6个基因均能获得可溶性表达,出现分子质量约为40 ku的蛋白条带,与预测大小一致。经Western-blot检测,能与HRP标记的His标签单克隆抗体结合。说明试验成功构建了ASFV MGF360蛋白的原核表达质粒,并表达纯化出目的蛋白。

老年慢性阻塞性肺疾病患者应用全科护理对其生活质量的影响研究

目的:研究全科护理治疗对老年慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmoriary disease,COPD)病人生活质量的影响。方法:选取100例在北京市怀柔区妇幼保健院接受治疗的老年COPD病人随机分为试验组和对照组,分别采用全科护理和正常护理的干预方法进行观察实验。结果:通过护理干预,试验组的患者生活质量得到了有效的改善,比正常护理的效果明显。具有统计学意义(P<0.05)。结论:全科护理干预可提高老年COPD病人的生活质量,值得临床应用。

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。

鸡传染性法氏囊病病毒rVP2蛋白高效组装亚病毒颗粒的鉴定

为获得高纯度的鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白自组装的亚病毒颗粒(subviral particles,SVPs),并对重组VP2蛋白(rVP2)SVPs的组装效率和均一性进行评价,本试验利用大肠杆菌表达IBDV rVP2,通过SDS-PAGE和Western blotting对蛋白表达情况和免疫反应性进行鉴定,通过阴离子交换层析和切向流超滤浓缩系统纯化rVP2蛋白,并通过透射电镜(TEM)、高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)、蔗糖密度梯度离心及粒径和表面电位(Zeta potential)等多种检测技术对单个SVP组装形态和整体组装情况进行分析检测,初步建立了IBDV rVP2 SVPs组装效率的系统性检测方法。结果显示,在大肠杆菌中实现IBDV rVP2的大部分可溶性表达,且能与鸡IBDV阳性血清有明显的免疫反应性,纯化后rVP2纯度提高66.9倍,回收率达到93.3%。TEM观察rVP2自组装成直径约25 nm的SVPs,视野内SVPs大小均一,均匀分散。HPSEC检测结果显示,rVP2 SVPs的分子质量约为2482 ku,与20个VP2三聚体形成的T=1二十面体SVPs分子质量一致。蔗糖密度梯度离心检测结果显示,rVP2 SVPs体积分布均一,组装效率高。粒径和Zeta电位检测结果表明,rVP2 SVPs颗粒分散度较好、体系稳定,有利于rVP2 SVPs的长期保存。本试验通过多种检测技术对rVP2 SVPs的组装情况进行检测分析,实现了rVP2 SVPs的高效组装,为IBDV SVPs疫苗的质量控制提供了有力支撑。

Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫效果研究

为评价Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2重组蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果,本研究利用FAV-HN株Fiber-2基因构建pET-30a-Fiber-2重组质粒,转化至BL21感受态诱导表达Fiber-2重组蛋白;Fiber-2蛋白纯化后制备不同抗原含量的亚单位疫苗,免疫SPF鸡进行免疫效力评价。结果表明,Fiber-2蛋白部分为可溶性表达,纯化后纯度约90%,AGP效价达1∶64。亚单位疫苗抗原含量AGP效价不低于1∶2时,SPF鸡免疫后第21 d AGP抗体10/10阳性,可抵抗Ⅰ群禽腺病毒(4型)强毒株的攻击,提供100%的免疫攻毒保护。

禽腺病毒血清4型Fiber-2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其免疫原性分析

旨在解决大肠杆菌表达系统对禽腺病毒血清4型(FAdV-4) Fiber-2蛋白进行表达时存在的多包涵体问题。通过添加不同的化学伴侣分子来提升Fiber-2的可溶性表达量,并进一步通过动物试验评价蛋白的免疫原性。结果显示,添加化学伴侣分子β-环糊精显著提高了Fiber-2的可溶性表达量,且重组蛋白与FAdV-4阳性血清具有良好的反应性,琼脂扩散(AGP)效价达1∶128;以表达的可溶性Fiber-2蛋白作为抗原,制备油乳剂疫苗并免疫SPF鸡,通过AGP检测免疫后血清中针对FAdV的特异性抗体水平,结果Fiber-2蛋白疫苗及FAdV-4全病毒灭活疫苗于免疫后14 d,均可诱生特异性的AGP抗体。以上结果表明β-环糊精显著提高了Fiber-2的可溶性表达量,且免疫原性良好。本研究为FAdV-4亚单位疫苗的研制及产业化奠定了基础。

表达PEDV S蛋白重组PRV的构建与生物学特性评价

将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株的S胞外区基因克隆至含有gG基因上、下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒pUC-ABK中,构建供体质粒pUC-ABK-S,获得线性同源重组片段AS-K-B。利用Red同源重组技术将线性同源重组片段电转化至含有pPRVBac-GFPTK-gE-gI-11k-28k-的感受态中获得重组pPRVBac-S,最后拯救获得重组病毒rPRV-S。PCR及IFA鉴定结果显示,S胞外区基因成功转录且表达,生物学特性评价结果表明重组病毒能够稳定遗传,为研制猪流行性腹泻病毒活载体疫苗提供了思路。

非洲猪瘟病毒免疫逃逸相关蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达纯化与鉴定

从GenBank中选取非洲猪瘟病毒(ASFV)SY18株的9个编码免疫逃逸相关蛋白的基因,通过密码子优化、添加促溶标签或截短表达的方法,构建大肠杆菌BL21(DE3)重组表达质粒,诱导ASFV免疫逃逸相关蛋白的表达,应用镍柱层析和Western-blot方法分别对这些蛋白进行纯化和鉴定。获得的9种大肠杆菌可溶性表达蛋白经Western-blot鉴定,结果显示,其中8种重组蛋白均能与ASFV阳性血清反应产生特异性条带,另外1种A224L蛋白与ASFV阳性血清不具有反应原性。最终,获得了9种纯度较高的ASFV免疫逃逸相关蛋白,为后续ASFV免疫逃逸机制的研究、诊断试剂及亚单位疫苗的研发奠定了物质基础。

我国近5年类NADC30 PRRSV毒株序列的重组及限制性片段长度多态性分析

为了解我国类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的流行和遗传变异情况,本研究利用生物信息学软件对本实验室2016-2020年获得的64条类NADC30毒株序列进行分析。Nsp2氨基酸序列比对结果表明,64株毒株均表现出与NADC30毒株一致的131个不连续的氨基酸缺失。其中,9株在Nsp2区域除该缺失特征外,另含有额外的氨基酸缺失。基于全基因组遗传演化分析结果表明,61株分布在Sublineage 1.8(类NADC30),3株分布在Lineage 8(HP-PRRSV)。而基于ORF5序列的遗传演化分析结果则更分散,56株分布在SubLineage 1.8,5株分布在Lineage 8,2株分布在Lineage 5(类VR2332),1株分布在Sublineage 1.5(类NADC34)。经RFP4和Simplot生物学软件进行重组分析结果表明,64株毒株中可能有44株为重组毒株,共表现出5种重组模式,其中以NADC30提供骨架,HP-PRRSV提供重组片段为主要模式。重组热点分布在非结构蛋白区域5′UTR~1500 nt(Nsp1)、5374~8177 nt(Nsp4~Nsp9)和结构蛋白区域12100~13279 nt(ORF2~ORF4)。RFLP结果表明,64条ORF5序列共存在12种RFLP模式,其中与美国高致病性变异株PRRSV RFLP1-4-4 Lineage1C相同的模式RFLP 1-4-4数量最多,共31株。综上所述,本研究为了解我国类NADC30毒株的遗传演化、重组分析和防控提供借鉴意义。

表达PEDV S1蛋白重组PRV的构建与鉴定

为了有效预防PED的感染,本研究将PEDV流行毒株的S1基因克隆至pcDNA3.1(+)载体中构建真核表达质粒,经鉴定S1蛋白表达后,获得S1基因表达盒,再将S1基因表达盒克隆至含有gG基因上下游同源臂以及抗性筛选基因的转移质粒PUC-ABK中,构建供体质粒PUC-ABK-CMV-S1,获得线性同源重组片段A-CMV-S1-K-B。利用Red同源重组技术将线性同源重组片段电转化至含有pPRVBac-GFP-TK--gE--gI--US9--2-的感受态中获得重组pPRVBac-S1,最后拯救获得重组病毒rPRV-S1。PCR及IFA鉴定结果显示S1基因成功转录且表达,为研制PEDV活载体疫苗提供了实验依据。

禽呼肠孤病毒σC重组蛋白的表达纯化与免疫原性分析

对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC基因进行大肠杆菌密码子优化,并将优化后的σC基因及其截短片段(122/156/192~326位氨基酸)克隆至pET-28a(+)载体,分别构建pET-28a(+)-σC,pET-28a(+)-σC-122,pET-28a(+)-σC-156和pET-28a(+)-σC-192重组载体。将测序鉴定正确的阳性质粒分别转化E.Coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导后产物经Western blot分析检测,显示σC及其截短蛋白σC-122、σC-156和σC-192在大肠杆菌中获得正确表达,相对分子质量分别为37000,25000,22000和18000,均能与ARV阳性血清发生特异性反应。本研究通过温度调控双水相萃取以及无机盐多步蛋白盐析沉淀前处理工艺,去除大肠杆菌表达重组蛋白中99%的内毒素。纯化后的σC及其截短蛋白,免疫21日龄SPF鸡,并于免后28 d进行抗体检测,结果显示截短蛋白免疫组血清抗体阳性比例仅为4/10,但重组蛋白σC免后抗体阳性比例可达到8/10,与全病毒类似,可作为ARV亚单位疫苗开发的候选蛋白。

非洲猪瘟病毒pS273R蛋白酶的可溶性表达与胞外活性鉴定

pS273R是ASFV编码的涉及多聚蛋白切割的蛋白酶,也是ASFV核心壳层的组成成分。利用分子伴侣在大肠杆菌表达非洲猪瘟pS273R蛋白酶,IPTG诱导可表达可溶性pS273R重组蛋白,分子量约31 kD。经Western Blot鉴定,表达的蛋白可与ASF阳性血清发生特异性反应,能够酶切杆状病毒表达的pp62,具有胞外活性。这些结果为研究ASFV组装机制和病毒复制抑制药物的开发提供了重要的生物材料。

基于重组技术的低毒力高效大肠杆菌原核表达系统的改造与应用

[背景]大肠杆菌作为原核表达系统常用宿主菌株,具有培养成本低、周期短和操作性强等优势,但同时也存在着一些不足。[目的]降低大肠杆菌内毒素合成水平及毒力,同时提高其可溶性表达外源蛋白的能力。[方法]利用CRISPR-Cas技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)脂多糖生物合成途径中的lpxM,改变其毒性中心类脂A的侧链结构;在基因组中整合表达tig提供蛋白折叠所需伴侣因子;构建pET-28a-Rcodon重组载体,补充蛋白表达所需稀有密码子对应的tRNAo[结果]lpxM缺失后菌体细胞内毒素合成水平较出发菌株降低90%左右;利用改造后的重组菌株和载体,可显著提高鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的可溶性表达水平;临床安全性试验结果表明,重组菌株BL21(DE3)ΔlpxM::tig合成内毒素的毒力水平较出发菌株显著降低,表达抗原对应免疫组个体无任何临床免疫副反应出现。[结论]利用重组技术对大肠杆菌原核表达系统进行改造,并用于外源蛋白的低毒力高效可溶性表达,为相关亚单位疫苗的研究奠定了一定的基础。

禽腺病毒(C种,4型)精制卵黄抗体研制及免疫效果评价

为了评价以禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白为免疫原制备精制卵黄抗体的免疫效果,本研究使用重组大肠杆菌BL21(DE3)-Fiber-2株诱导表达禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白,蛋白纯化后制备免疫原,免疫产蛋鸡收获高免蛋,经提纯获得的精制卵黄抗体AGP效价达1∶8;将精制卵黄抗体注射SPF鸡进行免疫效果评价。结果表明,精制卵黄抗体经肌肉或皮下注射SPF鸡,注射后7d内可100%保护鸡群抵抗禽腺病毒(C种,4型)强毒株的攻击,另外强毒株人工感染后24 h内肌肉或皮下注射抗体1.0 mL/只,可为感染鸡提供90%~100%的保护。本研究表明,以原核表达制备的禽腺病毒(C种,4型)Fiber-2蛋白为免疫原制备的精制卵黄抗体免疫效果较为理想,为后续抗体的临床应用提供了技术参考,并为该病的防控提供了新的思路。

非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的表达与单克隆抗体的制备

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)DP96R蛋白单克隆抗体,根据大肠杆菌密码子优化后的DP96R基因序列设计引物,PCR扩增后连接表达载体pET28a-SUMO构建pET-SUMO-DP96R原核表达质粒,将该质粒转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导,获得可溶性的DP96R蛋白。通过Western blot鉴定该蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,共制备了14株针对DP96R蛋白的单克隆抗体。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1、IgG2a,轻链亚类均为κ。采用DP96R蛋白为抗原的间接ELISA方法检测抗体的效价均不低于1∶2 560 000, 14株单克隆抗体均能够特异性识别DP96R蛋白。本试验为进一步研究DP96R蛋白生物学功能及ASFV基因缺失疫苗开发提供了重要的生物材料。

非洲猪瘟病毒pK205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。

三种禽病毒抗原的串联表达、纯化及活性鉴定

为实现多个基因在同一菌株中均一可溶性表达,简化基因工程亚单位多联多价疫苗中抗原生产的工艺步骤,本研究选用Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-2蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白和减蛋综合征病毒(EDSV)Fiber蛋白3种来自不同禽病毒的抗原为研究对象,利用原核表达系统,通过密码子优化、载体启动子改造和基因串联顺序优化,获得单一载体/多重转录单元的共表达重组质粒。将共表达重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行3个基因的共表达。纯化后的蛋白进行Western blotting和蛋白活性检测。结果表明,目的基因经过密码子优化、载体启动子改造和基因串联顺序的优化后,获得均一可溶性共表达的3种蛋白,纯化后蛋白纯度大于80%,Western blotting分析和琼脂扩散试验表明串联表达的3种蛋白具有免疫反应性和抗原活性。文中通过目的基因密码子优化、表达载体启动子改造和基因串联等关键技术的突破,首次实现了3种不同禽病毒抗原的高效、均一、可溶性串联表达和纯化,为基因工程亚单位多联多价疫苗的研制奠定了基础。