糖尿病致栓性因素的研究进展

糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者的代谢紊乱打破了凝血、抗凝和纤溶系统的平衡,导致以凝血抗凝功能异常和纤溶功能低下为特征的血栓形成前状态。多数DM患者处于血栓前状态,由此引发的心血管并发症是其主要死亡原因。凝血、抗凝和纤溶系统失衡在糖尿病患者血栓形成过程中发挥着重要作用。基于此,本文就糖尿病疾病进展过程中凝血、抗凝和纤溶系统变化进行综述,以期为糖尿病致栓性研究提供参考,同时也为其血栓防治提供新思考。

基于APP/PS1双转基因小鼠初探输血传播阿尔茨海默症的风险

目的初探输血传播阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)的风险。方法3、6、9月龄APP/PS1小鼠各10只,雌雄各半,认知行为学能力测定,同龄C57小鼠作对照;采集上述尚未出现行为学改变的最大月龄APP/PS1小鼠血液,检测Aβ_(40)、Aβ_(42)含量后备用。制备Aβ_(40)、Aβ_(42)聚合物,免疫印迹分析后备用。6~7月龄昆明小鼠随机分为6组(10只/组,雌雄各半),实验组1~2尾静脉注射APP/PS1小鼠血液(100μL/只),1组为高频次注射(3次/周),2组为低频次注射(1次/周);实验组3~4注射Aβ_(40)、Aβ_(42)聚合后混合物(100μL/只),分别为高、低频次注射,具体同上;对照组1~2注射等量生理盐水,分别为高、低频次注射。上述组别注射均持续4周,注射完毕1周后进行认知行为学能力检测及分析,最后检测昆明小鼠血液Aβ_(40)、Aβ_(42)含量。结果3、6月龄APP/PS1小鼠未出现认知行为能力改变,9月龄APP/PS1小鼠出现认知行为能力改变。6~7月龄APP/PS1小鼠血液中Aβ_(40)、Aβ_(42)含量(pg/mL)分别为418.40±2.18、15.68±0.20。所制备Aβ_(40)、Aβ_(42)聚合后混合物除单体外,多为二、三聚体。无论是高频,还是低频,输注APP/PS1小鼠血液的昆明小鼠(实验组1~2)与对照组相比,在旷场试验和条件恐惧试验中出现一定焦虑样行为和短期记忆缩短,但无显著差异;其它实验组(实验组3~4)与对照组相比,在旷场试验、新物体识别、巴恩斯迷宫、条件恐惧认知行为学分析中无明显区别。ELISA检测所有实验及对照组的昆明小鼠血液Aβ_(40)、Aβ_(42)含量(pg/mL)为10.30±0.08、3.360±0.005,组间差异不明显。结论输注APP/PS1小鼠血液及Aβ_(40)、Aβ_(42)聚合后混合物对健康昆明小鼠认知功能在短期内无明显影响,AD传播风险较小。

4种静注人免疫球蛋白制品的自身IgG抗体多样性研究

目的建立静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)制品自身IgG抗体谱展示方法及抗体种类分析方法,考察比较国内不同血液制品企业市售IVIG自身IgG抗体多样性。方法收集我国4个血液制品企业IVIG为研究对象,以人脐静脉内皮细胞总蛋白为抗原,通过双向电泳结合蛋白印记方法展示不同IVIG的自身抗体谱,通过IVIG与人类蛋白质组芯片杂交,高通量鉴定不同IVIG中自身抗体的种类并进行生物信息学分析。结果建立了IVIG自身抗体谱展示方法和抗体种类分析方法,获得了较高质量的IVIG自身抗体谱以及其能够识别的人自身蛋白的生物学信息,不同IVIG制品识别自身抗原的数量、种类有明显差异。4个制品针对人脐静脉内皮细胞蛋白抗体数量分别为241~386个;识别人蛋白质芯片上蛋白数量分别为292~435个,有172个人自身蛋白被4个制品均识别。结论利用抗体谱展示和蛋白质芯片技术能够用于分析IVIG中自身IgG抗体数量及种类多样性,检测的4个厂家IVIG制品中均具有广谱自身抗体,且具有各自的独特性。

不同来源的人血清白蛋白对1-磷酸鞘氨醇的结合运载作用研究

目的研究不同来源的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)对1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的结合运载作用。方法以人血浆来源HSA(plasma derived HSA,pHSA)和基因重组HSA(recombinant HSA,rHSA)样本为研究对象,首先利用LC-MS/MS技术,比较分析上述样本中S1P含量的差异;其次,在生理浓度条件下,向HSA样本中直接添加S1P进行负载处理,比较不同来源的HSA对S1P结合作用;在无血清培养条件下,将不同来源HSA样本与HUVEC细胞进行共培养,分析不同处理组的细胞培养上清中S1P含量的变化,比较不同来源的HSA对细胞中S1P的运载作用。利用表面等离子体共振SPR技术分析不同来源HSA与S1P分子的相互作用情况并计算其亲和力大小。利用AutoDock Vina软件和Molprophet平台,对HSA和S1P进行分子对接分析,并预测HSA中S1P的关键结合口袋域。结果S1P含量检测结果显示,所有pHSA样本中均含有一定水平的S1P(3.31±0.03~30.35±0.07)μg/L,且不同厂家生产的pHSA样本中的S1P含量差异显著(P<0.001);然而所有rHSA样本中均未检测出S1P。负载处理结果显示,不同来源HSA对S1P的结合作用存在显著差异(P<0.001),且rHSA对S1P平均负载量约为pHSA的2倍(ΔC_(rHSA)=801.75±142.45μg/L vsΔC_(pHSA)=461.94±85.73μg/L;P<0.001,t=5.006)。共培养处理结果显示,所有HSA样本处理组与HUVEC细胞共培养处理6h后上清中的S1P浓度均明显升高,而空白对照组上清中S1P浓度无变化;处理6 h、12 h和24 h后各处理组间上清中S1P浓度均存在显著差异(P<0.001)。SPR分析结果显示,与rHSA相比,pHSA与S1P之间的亲和力更高(KD_(pHSA-S1P):2.38E-06,KD_(rHSA-S1P):3.72E-06)。分子对接分析和结合口袋预测发现,HSA与S1P的关键结合口袋可能位于HSA分子的IB亚结构域。结论不同来源的HSA对S1P均具有一定的结合运载作用,但这种作用差异具有统计学意义,与HSA分子的IB亚结构域存在关联。

献浆者因素及保存条件对部分凝血因子的影响

目的系统分析ABO血型系统、年龄、性别及保存条件等对血浆中凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性和纤维蛋白原(Fbg)含量的影响。方法用凝固法检测101份不同血型、年龄、性别的来自正常献浆者的新鲜冰冻血浆中的FⅧ活性和Fbg含量。10份非O型(A、B、AB型)的血浆在融化分样后分别保存在4℃和室温(24±2℃)条件,然后在0、1、2、3、4、5、6、8、12、16、20和24 h分别检测FⅧ:C和Fbg含量。结果血型对FⅧ:C有显著性影响,O型比非O型个体低约28%(P<0.05),但对Fbg含量无影响。FⅧ(r=0.41,P<0.05)和Fbg(r=0.46,P<0.05)与年龄有显著的线性相关,都随年龄的增加而增加,每增长1岁,FⅧ:C约增加1%。51-56岁的比小于30岁的人群中FⅧ和Fbg均高约30%。性别对FⅧ和Fbg均无显著性影响。4℃和室温两种保存条件对FⅧ和Fbg无显著性影响。保存24 h,FⅧ活性减少约30%(P<0.05),Fbg含量基本无变化。结论 FⅧ:C和Fbg含量随年龄的增高而增高,O型人群比非O型的FⅧ显著地低,性别对FⅧ和Fbg均无影响。24 h内,4℃和室温2种保存条件对FⅧ和Fbg无显著性影响,FⅧ随时间降低,而Fbg基本无变化。

从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。

血液中的生长分化因子11在抗衰老领域的研究进展

生长分化因子11(GDF11)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一员,在人、小鼠、大鼠、马、羊等多个物种中广泛表达,具有多重生物学功能,在胚胎发育中的前/后轴模式、修复骨骼肌、骨骼形成、血管及神经新生等方面起着重要作用。近年来的研究发现,人血液中的GDF11可以逆转年龄相关的心肌肥大、骨骼肌功能障碍、认知功能减退等,提示GDF11在抗衰老领域有潜在应用价值。然而,也有一些专家质疑GDF11在抗衰老中的作用。本文系统介绍GDF11的结构特征、其在抗衰老领域的研究进展及目前存在的一些争议等,为今后GDF11在抗衰老中的研究工作提供思路。

低温乙醇法影响蛋白C的抗凝活性的研究

目的人血浆蛋白C(protein C,PC)是在肝脏中合成的一种维生素K依赖性的丝氨酸蛋白酶原,是体内重要的抗凝剂。Cohn组分Ⅳ(Cohn FractionⅣ,CFⅣ)是常规工业化血浆蛋白生产过程(低温乙醇法)中的副产物,其中包含了血浆中大约90%的蛋白C。调查3批次低温乙醇法生产血浆蛋白的原料血浆和产生的CFⅣ中的蛋白C的抗原含量、酰胺酶活性和抗凝活性,分析低温乙醇法是否影响蛋白C的抗凝活性。方法将CFⅣ按1∶10(w/v)加入20mmol/L的枸橼酸钠缓冲液,4℃搅拌5h,抽提出CFⅣ中的蛋白C,并尽可能多的挥发其中的乙醇后,离心(4℃,6500g),弃去沉淀。

洗脱条件及其因素对凝血酶原复合物有效成分的影响

目的探讨洗脱条件及其因素对凝血酶原复合物(PCC)中凝血因子(F)Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及蛋白(P)C、S、Z、抗凝血酶(AT)8种有效成分收率及比活的影响。方法选择洗脱条件中柠檬酸钠、NaCl、pH 3种可变因素,每因素取3水平,根据正交表配制不同洗脱体系;采用DEAE-Sephadex A-50凝胶,相同平衡、洗涤条件及上述不同洗脱体系,批式吸附法制备PCC浓缩物;检测浓缩物中8种成分的活性或含量,获得各成分的收率及比活;正交试验分析不同洗脱条件及其因素对8种成分收率及比活的影响。结果不同洗脱条件8种成分收率及比活有一定差异,2.4 mol/L NaCl条件比活总体较高。在所考察范围内,柠檬酸钠对FⅡ、FⅨ、FⅩ、PC、AT收率和PC、PS、AT比活有较大影响;NaCl对FⅦ、FⅩ、PS、PZ收率和FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、PZ比活有较大影响。不同水平条件,柠檬酸钠及NaCl含量越高,4种凝血因子收率与比活越高,但对4种抗凝蛋白收率及比活影响无规律;pH6.6水平,4种凝血因子收率较高,pH6.9,其比活较高,pH对4种抗凝蛋白收率与比活的影响无规律。结论洗脱条件中高浓度的NaCl可提高PCC的整体比活;低浓度的柠檬酸钠对PCC有效成分收率及比活也有较大影响;pH对PCC中凝血因子(FⅡ,Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ)收率及比活的影响分别有共性,对抗凝蛋白(PC,PS,PZ,AT)的影响则无规律。

人α1-抗胰蛋白酶缺乏症的临床治疗及α1-PI规模化制备的进展

α1-抗胰蛋白酶（alpha-1-proteinase inhibitor,α1-PI或α1-antitrypsin,α1-AT）是由肝细胞合成的1种丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）,它最重要的生理功能是在肺内抑制弹性蛋白酶的活性[1]。1963年,Laurell和Eriksson[2]报道了遗传性α1-PI缺乏及其与患者早年（30~40岁）发生肺气肿的关系。

凝血酶原复合物制备过程吸附条件的研究

目的探讨凝血酶原复合物制备过程凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附条件,提高活性收率。方法选择DEAE-SephadexA-50凝胶平衡体系中柠檬酸钠、氯化钠、pH 3种可变因素,每因素取3水平,根据L9(33)正交表设计试验,配制平衡液,分别对DEAE-SephadexA-50凝胶进行平衡处理后,按1.67g/L加入等量健康人混合去冷沉淀血浆,4℃搅拌,吸附凝血因子;吸附后凝胶洗涤、洗脱,检测洗脱液中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性并进行活性回收率正交试验直观分析,获得较优吸附条件并进行验证。此外,分析吸附平衡体系电导率与4种因子活性收率间关系。结果柠檬酸钠、氯化钠、pH对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ吸附影响不同;在所考察范围内,pH对4种凝血因子吸附影响效应趋势一致,pH越低,吸附效果越佳;柠檬酸钠及氯化钠浓度对4种凝血因子吸附影响效应趋势不一致,柠檬酸钠浓度越高,凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ吸附越佳,而凝血因子Ⅸ在(0.012～0.02)mol/L水平较佳;氯化钠浓度越低,凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ吸附越佳,而凝血因子Ⅹ在(0.1～0.14)mol/L水平较佳;平衡体系电导率与4种因子活性收率间不存在线性关系。结论吸附条件中pH及柠檬酸钠浓度对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ吸附效果影响较大。柠檬酸钠(0.02～0.028)mol/L,氯化钠(0.02～0.06)mol/L,pH6.6～6.9条件,4种凝血因子吸附效果相对较佳。电导率对4种因子吸附效果影响不明显。

不同吸附体系及因素水平对PCC中4类抗凝蛋白的影响研究

目的探讨不同吸附体系及其柠檬酸钠、氯化钠、pH、电导4因素对凝血酶原复合物(PCC)中蛋白C、蛋白S、蛋白Z、抗凝血酶收率及比活的影响。方法选择柠檬酸钠、氯化钠、pH3因素3水平设计正交试验,配制9种PCC平衡吸附体系;凝胶平衡后,吸附血浆,洗涤、洗脱,制备PCC浓缩物;测定浓缩物中蛋白C和S、抗凝血酶活性、蛋白Z含量、总体积及蛋白浓度,获得四类抗凝蛋白收率及比活,比较不同吸附体系收率、比活总趋势;利用正交试验直观分析法分析柠檬酸钠、氯化钠、pH对蛋白C、S和Z收率及比活的影响;测定吸附体系电导率,分析电导率与4类抗凝蛋白收率及比活的关系。结果不同吸附体系4类抗凝蛋白收率及比活有较大差异,抗凝血酶二者均极低。柠檬酸钠对蛋白C收率及比活、蛋白S收率影响较大;pH对蛋白S比活、蛋白Z收率及比活影响极差分别为:0.120、6.847、0.716,高于其他因素;氯化钠对其影响均最小。柠檬酸钠浓度越低,蛋白C收率及比活越高,蛋白S收率则越低,0.015 mol/L水平蛋白Z收率为49.11%,高于其他水平,而蛋白S和Z比活最低;pH越低,蛋白Z收率则越高,pH7.0水平蛋白C和S收率及比活、蛋白Z比活最高;氯化钠浓度0.075 mol/L水平,蛋白C收率及比活、蛋白S和Z比活分别为:29.37%、0.533 IU/mg、0.401 IU/mg、2.362μg/mg,均高于其他水平,而蛋白S、Z收率最低。不同电导率条件,蛋白C收率及蛋白Z比活变化较大,其中蛋白Z与S收率、蛋白Z与S比活、蛋白C收率与比活变化趋势基本一致;(10.00±0.20)ms/cm条件,蛋白C、S和Z比活较高。结论不同吸附体系抗凝血酶收率及比活均极低,蛋白C、S和Z收率及比活间无规律性。氯化钠对蛋白C、S和Z收率及比活影响较小,柠檬酸钠、氯化钠、pH不同水平对蛋白C、S和Z收率影响效应无共性,0.01 mol/L柠檬酸钠,0.075 mol/L氯化钠、pH7.0水平蛋白C、S和Z比活最佳。电导率与四类抗凝蛋白收率及比活间无线性关系。

粉土地基真空井点降水效果及土颗粒迁移效应

为研究粉土地基中群井条件下的真空井点降水过程及降水效果,进行了现场试验。试验表明,群井条件下,随井点间距的减小和井点深度的增大,水位下降要快得多。由于群井降水具有显著的三维空间效应,所以,群井降水引起的地下水位降低要比单排井点和单井点更为显著,同时,降水引起的地下水位下降范围也更大,这一效应随井点深度的增加更为明显。由现场取得原状土样进行的室内渗透试验表明,连续抽水后,在真空和水力的双重作用下,土层中的土颗粒有明显的迁移,导致地层中土的孔隙比增大,渗透系数也明显增大。

不溶性血小板膜颗粒的制备及其功能初探

目的制备具有止血功能的不溶性血小板膜(IPM)颗粒。方法过期的浓缩血小板经过差速离心去除红细胞、白细胞和血浆,用生理盐水悬浮,经冻融破碎、离心洗涤、超声匀浆,获得大小较均一的IPM颗粒;检测其理化和功能指标:IPM颗粒大小、表面蛋白受体、聚集功能和凝血酶生成能力。结果制备得到的IPM颗粒大小为140nm左右,其表面含有糖蛋白GPⅠbα(CD42b)、糖蛋白GPⅡb-Ⅲa(CD41/CD61)、血小板内皮细胞粘附分子(CD31)、P-选择素(CD62p);体外功能试验显示:IPM颗粒在瑞斯托霉素和Ⅲ型胶原诱导下能发生聚集;凝血酶生成试验证实:IPM能为凝血因子Ⅹ酶复合物和凝血酶生成提供催化表面,参与凝血级联反应。结论应用冻融和超声相结合的方法成功制备出大小均一的IPM颗粒,其表面保留了与止血功能相关的蛋白受体;在血小板聚集诱导剂的刺激下IPM颗粒可以发生聚集反应,初步表现为止血功能。

中国市场人凝血因子Ⅷ质量分析

目的考察了5种、11个批次的中国市场人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品,分析相关制品的成份。研究对国内制品的有效性和安全性做出评估,为建立新的制品质量标准提供理论依据。方法选用S公司人FⅧ、CSL Alevi-ate、+公司人FⅧ、L公司人FⅧ和Bayer KogenateFS,通过FⅧ测定进行制品活性评估,通过FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ分析杂质蛋白含量,用3种不同蛋白测定方法测定制品总蛋白含量;初步评价von Willebrand Factor(vWF)活性,并用非还原和还原SDS-PAGE电泳分析纯度。结果不同制品在活性检测、蛋白含量测定和电泳纯度评估中均有不同的表现差异。结论不同的工艺制备流程导致不同的制品质量;凝血因子类制品测定不同的方法、设备和检测试剂盒都对数值造成不确定性;甘氨酸影响Bradford法总蛋白含量测定,目前考察的几种FⅧ的关键性质量参数-比活性均大于WHO高纯度(10 IU/mg)和2010版中国药典(1IU/mg)的要求。

洗涤条件不同因素及其水平对凝血酶原复合物的影响研究

目的探讨凝血酶原复合物制备过程洗涤条件中不同因素及其水平对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ收率及比活的影响。方法选择DEAE-SephadexA-50凝胶洗涤液中柠檬酸钠、氯化钠、pH3种可变因素,每因素取3水平,设计正交试验,配制9种洗涤液,进行9组实验。9等份A-50凝胶干粉平衡处理后,按每克凝胶干粉1.60L的比例,分别加入等量健康人混合去冷沉淀血浆,4～6℃条件下,搅拌吸附凝血因子;吸附后A-50凝胶分别用对应的洗涤液洗涤3次后洗脱,收集洗脱液获得凝血酶原复合物浓缩物,重复3次实验。检测洗脱液蛋白浓度及凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性,计算不同洗涤条件制备的凝血酶原复合物浓缩物中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的收率及比活。

离子交换层析分离纯化人α1-抗胰蛋白酶

目的建立一种新的用离子交换层析从Cohn组分IV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)制剂的工艺。方法以Cohn组分Ⅳ为原料,用12倍体积20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解后,加入2.5%气相二氧化硅搅拌吸附脂蛋白等杂质。抽提液经离心收集上清,再用0.45μm滤膜过滤。将滤液上样于CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱,收集未吸附的流穿蛋白液。再将收集的流穿液上样于Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱,上样及平衡液清洗后,用含60mmol NaCl的缓冲液洗涤杂蛋白,再用含100mmol/L NaCl的缓冲液洗脱,收集洗脱液。

亲和凝胶分离纯化人α1-抗胰蛋白酶的研究

目的探索通过免疫亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化人α1-抗胰蛋白酶浓缩物的方法。方法 24℃下,将Cohn氏法组份Ⅳ用Tris缓冲液抽提0.5 h后,离心4 750 g×15 min,上清液加入亲水型气相二氧化硅脱脂后,离心6 000 g×15 min,再用1.2μm的滤膜过滤;通过GE公司新型的Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和凝胶层析柱,对α1-抗胰蛋白酶进行纯化。用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;用SDS-PAGE鉴定α1-抗胰蛋白酶的纯度,并用Western Blot和串联质谱分析鉴定纯化的蛋白;通过发色底物法测定α1-抗胰蛋白酶活性。结果纯化的α1-抗胰蛋白酶在非还原性SDS-PAGE图谱上呈现1条54 kD左右的蛋白带和1条约140 kD的多聚体蛋白带,经过还原性SDS-PAGE多聚体条带解聚,Western Blot也可以反应相关变化;在经过前处理和亲和层析后,α1-抗胰蛋白酶活性回收率为(60.35±1.39)%,α1-抗胰蛋白酶总活性回收率为(41.88±6.98)%,纯化倍数为(71.68±1.32)倍,比活性大约(1.00～1.05)PU/mg。结论 GE公司Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和层析亲和层析可以从Cohn氏法组份Ⅳ中特异性捕获α1-抗胰蛋白酶浓缩物。