赖氨大黄酸对胆汁淤积性肝纤维化大鼠Smad2、Smad3表达的影响

目的探讨赖氨大黄酸(RHL)对胆汁淤积性肝纤维化模型大鼠Smad2、Smad3表达的影响。方法采用胆总管结扎(BDL)的手术方法建立大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型,将大鼠随机分为5组:对照组、模型组、赖氨酸组、低剂量RHL组[35mg/(kg·d)]、高剂量RHL组[70mg/(kg·d)]。应用实时荧光定量PCR的方法检测大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3mRNA的相对表达量。Western blot的方法检测Smad2、Smad3蛋白时相对表达量的变化。结果与模型组大鼠比较,经RHL治疗后胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组大鼠相比,经RHL治疗后胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3蛋白的相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RHL能够抑制肝纤维化的发展,可能是通过抑制Smad2、Smad3mRNA和蛋白的表达,阻断TGF-β1/Smads信号传导通路实现的。

miR-185对肝癌细胞生长增殖及侵袭迁移的影响

目的探讨miR-185对人肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721生长增殖、侵袭迁移能力的影响。方法构建miR-185过表达载体、合成miR-185反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO),经脂质体转染肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721。利用CCK-8和Transwell小室实验检测细胞的增殖、侵袭和迁移能力;生物信息学数据库预测结合基因芯片结果确定miR-185的候选靶基因NR1D1;利用实时荧光定量PCR技术和Western blot检测miR-185对细胞中NR1D1基因表达水平的影响;荧光报告载体实验验证miR-185对靶基因的调控作用。结果 miR-185在人肝癌细胞中的mRNA表达水平显著低于正常肝细胞(P<0.01);过表达miR-185使人肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低,下调肝癌细胞中NR1D1基因的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01);荧光报告载体实验证明miR-185可以通过作用于NR1D1 mRNA的3'端非翻译区(untranslated region,UTR)下调其表达水平(P<0.05)。结论 miR-185能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭迁移能力,NR1D1是miR-185的直接靶基因。

赖氨大黄酸通过调控miRNA表达水平抑制HBV增殖

目的研究赖氨大黄酸在体外对乙型肝炎病毒(HBV)增殖及病毒抗原表达的影响及分子机制,为研究赖氨大黄酸抗HBV作用机制奠定初步的实验依据。方法将HepG2.2.15细胞分为实验组(分别加入5、10、20、40、80μmol/L赖氨大黄酸)及不加赖氨大黄酸的对照组,分别培养24、48h收获上清液,采用四唑氮化合物(MTS)法检测细胞的增殖活性,采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg的表达水平,实时定量PCR(RT-PCT)检测其中HBV DNA的拷贝数及miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184、miR-217的表达水平。miR-210、miR-185、miR-199a-3p、miR-370、miR-196a、miR-184、miR-217反义链(ASO)分别转染HepG2.2.15细胞后,MTS法检测细胞的增殖活性,ELISA法检测HBsAg和HBeAg的表达水平。结果在没有对HepG2.2.15细胞的增殖活性产生影响的情况下,赖氨大黄酸抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖。20μmol/L的赖氨大黄酸明显促进了miR-210、miR-185、miR-199a-3p的表达,而抑制了miR-370的表达,与对照组相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论赖氨大黄酸可能通过影响细胞内miRNA的表达抑制HepG2.2.15细胞中HBV的增殖和HBsAg的产生。

MiR-199a-5p对肝星状细胞活化增殖的影响

miR-199a-5p是miRNAs家族的一员。为探讨对人肝星状细胞活化增殖和迁移的影响,为临床肝纤维化治疗提供新的思路,本研究构建miR-199a-5p过表达载体、合成miR-199a-5p反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)经脂质体转染LX-2细胞。采用CCK-8法和Transwell分别检测细胞增殖和迁移能力;集落形成实验检测LX-2细胞的集落形成能力;实时荧光定量PCR技术检测细胞中转染miR-199a-5p后纤维化相关基因α-SMA和CollagenⅠ的mRNA表达水平;Western blot检测各组细胞中α-SMA表达水平。结果表明miR-199a-5p可以促进LX-2细胞增殖(P<0.01)、迁移(P<0.01)和集落形成(P<0.01);而ASO-199a-5p-5p组细胞增殖(P<0.01)、迁移能力(P<0.01)和集落形成能力(P<0.01)受到抑制。RTqPCR结果显示miR-199a-5p在受TGF-β1刺激后的LX-2细胞中的miRNA表达水平高于未受刺激组的(P<0.05),转染miR-199a组细胞中α-SMA的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)表达水平升高。以上结论表明miR-199a-5p过表达能促进肝星状细胞活化、增殖。