猪细小病毒3型VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测猪细小病毒3型(PPV3)的间接ELISA方法,本研究选取PPV3 VP2多表位亲水区序列设计引物,扩增并原核表达该基因片段,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了PPV3间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该检测方法仅对PPV3血清检测为阳性,与PPV1、PPV2、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒等的标准阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。本研究为临床上PPV3的检测提供了血清学检测手段。

5种中药总黄酮成分体外抗病毒作用观察

为筛选抗病毒中药黄酮成分复方的主药,采用MTT法观察了淫羊藿、黄芩、忍冬藤、三七和菟丝子5种中药总黄酮成分对鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的影响,并采用先加黄酮后接种病毒、先接种病毒后加黄酮、黄酮与病毒同时感作3种加药方式观察了各黄酮成分抗新城疫病毒(NDV)感染CEF作用。结果表明:5种中药总黄酮成分在一定质量浓度下均能促进CEF增殖或延长细胞存活时间;在安全浓度范围内的5个稀释浓度下,各总黄酮成分均有不同程度的抗病毒活性,尤其以淫羊藿黄酮在先加黄酮后接种病毒和先接种病毒后加黄酮且质量浓度为31.30μg·mL-1时,以及31.30μg·mL-1黄酮与病毒同时加入时的A570值显著大于病毒对照与细胞对照;黄芩黄酮在先接种病毒且浓度为7.80～3.90μg·mL-1时,其A570值显著大于病毒对照(P<0.05)和细胞对照(P<0.05)。最高病毒抑制率以淫羊藿黄酮最高,其次是黄芩黄酮,分别达189.70%和158.82%。结论:淫羊藿总黄酮和黄芩总黄酮具有较显著的体外抗病毒效果,可作为抗病毒中药总黄酮成分复方的主药成分。

3种猫疱疹病毒Ⅰ型检测方法的比较

比较传统PCR、荧光定量PCR以及胶体金速测卡对于猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)检测的敏感性及准确性。设计引物,优化反应条件并扩增目的片段,定向插入p MD-19T克隆载体,最后用建立的2种PCR检测方法及猫疱疹病毒1型快速检测卡对21份临床疑似猫疱疹病毒感染的分泌物进行检测。荧光定量PCR和传统PCR检测的最低拷贝数分别为20拷贝和207拷贝;荧光定量PCR、传统PCR以及胶体金快速检测卡的检出率分别为71%、57%和29%。传统PCR及荧光定量PCR检测方法均具有良好的特异性,其中荧光定量PCR特异性显著,相比猫疱疹病毒1型快速检测卡敏感性好,准确率更高。

2014—2015年我国华东部分地区猪流行性腹泻病毒的检测及S基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2014年至2015年送至实验室的104份腹泻仔猪小肠组织病料进行检测,结果显示42份为猪流行性腹泻病毒（PEDV）阳性,选择不同地区的7份阳性病料进行S基因克隆和测序,并与Gen Bank中已发布的PEDV S基因比对分析。核苷酸和氨基酸比对结果显示,7株流行毒株S基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别是98.1%～99.2%和97.6%～99.1%。该7株流行毒株与经典毒株CV777和DR13核苷酸序列的同源性分别为94.0%～94.2%和93.9%～94.1%,氨基酸序列的同源性分别为93.1%～93.6%和92.5%～93.1%。S基因进化树分析结果表明,根据S基因的变异情况PEDV可以分为3个型,本试验分析的7株PEDV流行毒株均属于Ⅲ型,与2012年以来中国流行毒株的亲缘关系较近,与国外传统毒株和中国较早分离到的毒株的亲缘关系较远。

猪细小病毒2型VP蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了有效监测猪细小病毒2型(PPV2)的抗体水平,选择PPV2VP蛋白主要亲水区及高抗原指数区进行原核表达。以表达的重组tVP蛋白为包被抗原建立了检测PPV2抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被浓度为0.8μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶20 000,检测的临界值为0.400 5(D450nm≥0.400 5判定为阳性)。特异性试验证明,与猪细小病毒1型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒O型血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。应用此方法对采自江苏省的480份临床血清样本进行了检测,PPV2抗体阳性率为31%。试验结果表明,tVP蛋白能很好地获得表达,以此蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床血清PPV2抗体的检测。

慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用

将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。