Tet1对海分枝杆菌感染过程中宿主炎症反应及肥大细胞活化的影响

目的:探讨Tet1分子在海分枝杆菌(Mm)感染小鼠过程中对宿主炎症反应及肥大细胞活化的影响。方法:SPF级Tet1野生型(Tet1^(+/+))和Tet1基因敲除小鼠(Tet1^(-/-))尾静脉接种相同数量的Mm,建立小鼠尾静脉感染模型。观察记录小鼠尾部大体病变,取鼠尾组织匀浆铺板培养比较菌载量;HE染色观察组织病理学变化,抗酸染色检测细菌分布;甲苯胺蓝染色观察小鼠尾组织中肥大细胞的分布及形态差异;免疫组化检测肥大细胞活化标志物类胰蛋白酶和5羟色胺(5-HT)的表达及分布差异。结果:尾静脉接种Mm后,Tet1^(+/+)小鼠尾组织出现渐进性脓肿和明显溃烂,而Tet1^(-/-)组小鼠尾巴仅发生散在性小面积肿胀;菌落计数发现Tet1^(+/+)小鼠细菌负荷逐渐增加,而Tet1^(-/-)小鼠菌载量显著降低(P<0.01);组织病理学观察发现,Tet1^(+/+)小鼠尾组织中大量炎症细胞浸润,表皮及真皮层胶原纤维断裂,且形成肉芽肿样病变,而Tet1^(-/-)小鼠镜下观察仅有炎症细胞散在分布;抗酸染色可见红色杆菌分布;甲苯胺蓝染色观察Tet1^(-/-)小鼠大多数肥大细胞结构完整,而Tet1^(+/+)小鼠尾组织中大量肥大细胞不完整且有颗粒物质释放;免疫组化染色发现类胰蛋白酶和5-HT的表达在Tet1^(+/+)小鼠中明显增加,而在Tet1^(-/-)小鼠尾组织中阳性信号很弱。结论:Tet1缺失可降低肥大细胞的活化与脱颗粒,并缓解Mm感染介导的炎症反应及组织病理损伤。

利用CRISPR/Cas9技术构建Fbxw7敲低的Raw264.7稳定细胞株及其生理功能检测

目的:应用CRISPR/Cas9技术构建Fbxw7表达抑制的Raw264.7稳定巨噬细胞株,并检测其生理功能。方法:转染Fbxw7_Cas9KO质粒到Raw264.7细胞,用含嘌呤霉素的培养基培养,挑取单克隆并筛选带荧光标记的细胞进一步培养;然后采用qRT-PCR和Western blot分别检测Fbxw7基因与蛋白表达水平;Confocal进一步检测Fbxw7蛋白表达分布;测序分析基因突变情况;CCK-8和流式细胞术分别检测Fbxw7基因敲低后Raw264.7细胞增殖能力与凋亡率。结果:Fbxw7敲低组的mRNA和蛋白表达水平较正常Raw264.7细胞显著降低,Confocal观察发现敲低组Raw264.7细胞中Fbxw7蛋白表达微弱;测序结果显示Fbxw7敲低组存在多位点突变;Fbxw7敲低后Raw264.7细胞增殖能力明显降低,凋亡率增加。结论:利用CRISPR/Cas9技术可以实现Fbxw7基因在Raw264.7细胞稳定低表达,所筛选出的稳定细胞株可用于后续细胞水平的实验研究。