意大利蜜蜂幼虫防御素Defensin-2在吡虫啉胁迫下的表达分析

防御素在昆虫免疫抵抗农药危害中具有重要作用,但蜜蜂防御素Defensin在幼虫抵御吡虫啉毒性中的作用鲜有报道。生物信息学鉴定意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica防御素Defensin-2,分析其在吡虫啉暴露下蜜蜂幼虫中的表达模式,探讨其在幼虫抵御吡虫啉中的作用。生物信息学方法分析Defensin-2的氨基酸序列特征、功能域、高级结构、互作靶标、系统进化聚类关系;RT-qPCR分析幼虫口服暴露吡虫啉后Defensin-2基因的表达特征。结果显示,Defensin-2蛋白由104个氨基酸残基组成,相对分子质量为11.9 kDa,等电点PI为8.54,具有信号肽和跨膜结构域。多重序列比对显示Defensin-2属于防御素样超家族。系统进化分析表明,Defensin-2聚类于蜜蜂家族;RT-qPCR分析表明,在半致死浓度吡虫啉暴露下,Defensin-2基因在24 h时显著上调表达后在72 h时下调表达,但在环境浓度吡虫啉暴露后72 h,Defensin-2表达量呈显著上调。Defensin-2可能在意大利蜜蜂幼虫抵御吡虫啉毒性中发挥着重要作用。

意大利蜜蜂转铁蛋白基因AmTsf在吡虫啉胁迫下的表达分析

[目的]通过生物信息学方法鉴定意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)转铁蛋白(AmTsf),分析该蛋白在该蜂种耐受杀虫剂吡虫啉毒性过程中发挥的作用。[方法]通过多重序列比对分析AmTsf的氨基酸序列特征和结构域组成;利用在线工具预测该蛋白的结构、细胞定位、互作蛋白网络和生物学功能,构建系统进化树分析该蛋白的系统分类和进化关系;采用实时荧光定量PCR结合铁稳态测定分析该蛋白的编码基因AmTsf在意大利蜜蜂耐受杀虫剂吡虫啉毒性过程中的应答特征和功能。[结果]AmTsf蛋白为疏水性蛋白,由712个氨基酸残基组成,相对分子质量为78.7 kDa, pI为6.77,具有信号肽和转铁蛋白家族保守的氨基酸残基,主要定位于细胞核和线粒体。环境剂量的吡虫啉暴露导致供试蜜蜂大量死亡;与对照组相比,吡虫啉暴露24 h后导致供试蜜蜂头部、胸部和中肠的Fe2+过剩,与铁稳态调节紧密相关的AmTsf在上述各组织中的表达均有统计学意义上的上调(p<0.05)。[结论]AmTsf可能通过调节铁稳态来参与意大利蜜蜂对吡虫啉毒性的耐受。

微孢子虫感染下意大利蜜蜂谷胱甘肽降解酶基因AmCHAC2的表达分析

[目的]通过生物信息学鉴定意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)谷胱甘肽特异性γ-谷氨酰环转移酶2(AmCHAC2),并通过定量PCR分析该蛋白的编码基因AmCHAC2在意大利蜜蜂组织中的时空表达特征,探讨该基因在蜜蜂抵抗微孢子虫感染中的作用。[方法]采用多重序列比对分析AmCHAC2的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测该蛋白的结构、互作蛋白网络、细胞定位特征和功能;构建系统进化树分析该蛋白的的系统分类和进化关系;实时定量PCR分析AmCHAC2在供试蜜蜂组织中的时空表达特征;采用试剂盒检测分析供试蜜蜂组织谷胱甘肽含量的表达特征;采用ELISA法检测分析供试蜜蜂中肠活性氧含量。[结果]AmCHAC2由245个氨基酸残基组成,相对分子质量为28.3 kDa, pI为6.71。AmCHAC2为疏水蛋白,不具备信号肽,定位于细胞质。供试蜜蜂在感染东方蜜蜂微孢子虫(Noseama ceranae)14 d后大量死亡,存活率仅为23%;与对照组相比,感染微孢子虫的供试蜜蜂胸部和中肠组织中AmCHAC2表达明显上调,GSH含量明显下降,且中肠内活性氧含量明显上升而触发氧化应激。[结论]AmCHAC2在受到东方蜜蜂微孢子虫感染后表达上调,这可能在意大利蜜蜂抵抗微孢子虫感染过程中扮演着重要角色。

意大利蜜蜂幼虫细胞色素P450单氧酶CYP9q1在吡虫啉胁迫下的表达分析

【目的】通过生物信息学方法鉴定一种意大利蜜蜂(Apis mellifera)细胞色素P450单氧酶(CYP450)即AmCYP9q1,分析吡虫啉暴露后不同时间点蜜蜂幼虫体内该蛋白编码基因的表达模式,探讨在吡虫啉胁迫下该蛋白的解毒作用。【方法】利用生物信息学程序,分析AmCYP9q1的氨基酸序列特征、结构域、高级结构以及蛋白互作网络,预测该蛋白的生物学功能;构建系统进化树,分析AmCYP9q1在昆虫CYP450家族中的分类和进化关系;通过RT-qPCR测定幼虫经吡虫啉口服暴露后24,72 h时AmCYP9q1基因的表达情况。【结果】AmCYP9q1由510个氨基酸残基组成,相对分子质量为58.8 kDa,等电点为8.91。AmCYP9q1为亲水性蛋白,不具有信号肽和跨膜结构域。多重序列比对和系统进化分析结果表明,AmCYP9q1为CYP450家族中CYP3 Clan成员,具有典型的CYP450家族共有的保守结构域特征。RT-qPCR分析表明,与对照组相比,吡虫啉口服暴露组的AmCYP9q1基因均呈统计学意义上的上调表达(p<0.05),并且暴露后72 h时的相对表达量显著高于暴露后24 h。【结论】AmCYP9q1属于CYP450家族中的CYP3 Clan,可能在意大利蜜蜂幼虫对吡虫啉的代谢解毒过程扮演了重要的角色。

铁硫簇组装蛋白在意大利蜜蜂耐受吡虫啉毒害中的应答分析

【目的】用生物信息学方法鉴定意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)铁硫簇组装蛋白(AmIscA),分析它在意大利蜜蜂工蜂耐受杀虫剂吡虫啉毒性中的应答特征。【方法】多重序列比对分析AmIscA的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测该蛋白的结构以及互作蛋白网络,预测它的生物学功能;构建系统进化树分析该蛋白的分类和进化关系;构建半致死模型,实时荧光定量PCR分析AmIscA基因在工蜂耐受杀虫剂吡虫啉毒性0~48h中的表达特征。【结果】AmIscA基因cDNA序列全长514bp,编码130个氨基酸残基,计算出AmIscA的相对分子质量为14.1kDa,pI为9.06。AmIscA为疏水性蛋白,具有铁硫簇组装蛋白保守的半胱氨酸和天冬氨酸残基,并且不具备信号肽,定位于线粒体中。经48h的半致死剂量吡虫啉暴露后的工蜂存活率为45%±5%。AmIscA基因表达受吡虫啉胁迫而上调,且呈先升高后下降趋势。【结论】AmIscA积极响应吡虫啉导致的毒性胁迫,可能通过抗氧化作用潜在地参与了意大利蜜蜂对吡虫啉毒性的耐受。

球囊菌黑色素样色素的亚细胞定位及感染功能初探

【目的】鉴定黑色素样色素在球囊菌(Ascosphaera apis)孢子的定位情况,分析它在球囊菌感染意大利蜜蜂(Apis mellifera)(以下简称意蜂)幼虫中的作用。【方法】以黑色素提取法提取和纯化球囊菌孢子的黑色素样色素,制备多克隆抗血清。通过间接免疫荧光定位技术分析类黑色素在孢子中的定位特征。分别以含有孢子、黑色素样色素、孢子及黑色素样色素、磷酸缓冲液的饲料喂食意蜂3龄幼虫,统计幼虫存活率,探讨黑色素样色素在孢子感染幼虫中的作用。【结果】经分离和纯化得到了球囊菌黑色素样色素,并将它注射入小鼠(Mus musculus)体内后成功制备了多克隆抗血清。间接免疫荧光亚细胞定位结果显示黑色素样色素主要分布在球囊菌孢子壁上。感染分析结果表明:与正常摄食对照组和磷酸缓冲液对照组相比,添食球囊菌孢子使意蜂幼虫存活率有统计学意义上的下降(p<0.05),单独添食黑色素样色素对意蜂幼虫存活率没有统计学意义上的影响;较单独添食孢子处理而言,同时添食球囊菌孢子和黑色素样色素使意蜂幼虫存活率有统计学意义上的下降(p<0.05)。【结论】球囊菌黑色素样色素定位于球囊菌孢子的细胞壁上,潜在的参与了球囊菌孢子对蜜蜂幼虫的感染。