梅花鹿鹿角盘蛋白的分离纯化及其对大肠杆菌抑菌机制的初步研究

目的分离纯化梅花鹿鹿角盘蛋白并对其抑菌机制进行初步探究。方法以鹿角盘为原料,采用酸提醇沉提取鹿角盘总蛋白,SephacrylS-100HR和反向高效液相层析分离纯化鹿角盘抗菌蛋白,最终确定蛋白质分子质量。以大肠杆菌为研究对象,测定抗菌蛋白的最小抑菌浓度(MIC);结合荧光显微镜、扫描电镜、流式细胞仪等方法从大肠杆菌细胞膜通透性、完整性和ROS活性氧的产生等方面探讨鹿角盘蛋白对大肠杆菌的抑制机制。结果 SephadexG-25除盐后总蛋白含量为90.3%,经SephacrylS-100HR凝胶层析获得分子量<20.1 kDa的蛋白组分S2对大肠杆菌具有抑菌活性,将S2(<20.1 kDa)组分通过反相高效液相得到抗菌蛋白18.963 kDa。抗菌蛋白在浓度为5 mg/mL时对大肠杆菌具有最小抑菌能力;处理组在一定时间内电导率、β-半乳糖苷酶活性的显著差异表明细胞膜通透性受损;扫描电镜发现抗菌蛋白作用后菌体出现变形、塌陷、皱缩、破碎,荧光显微镜观察PI单染处理组荧光强度增强,说明抗菌蛋白破坏了大肠杆菌细胞膜、细胞壁的完整性;菌体经抗菌蛋白浓度为2倍最小抑菌浓度(2 MIC)处理2 h,流式细胞仪检测ROS表达量为69.3%,菌体氧化应激水平显著提高,从而对大肠杆菌起到一定的抑制作用。结论鹿角盘蛋白经过分离纯化后得到的抗菌蛋白可能通过改变大肠杆菌细胞膜通透性、细胞壁完整性和提高菌体氧化应激水平,从而起到抑菌的作用。

梅花鹿鹿角盘胶原肽制备及其活性作用研究

目的研究梅花鹿鹿角盘胶原肽的护肤作用并优化酶解法提取胶原肽的工艺。方法以热水法提取的胶原蛋白为原料,胶原蛋白水解度为指标,采用胰蛋白酶酶解梅花鹿鹿角盘胶原蛋白。借助单因素试验、Box-Behnken设计试验来优化制备鹿角盘胶原肽的工艺。在10、20、30、40、50 g/L浓度范围内探究胶原肽的抗氧化能力及还原能力。将40只昆明小鼠随机均分为空白组、对照组及胶原肽溶液低、中、高剂量组(0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L),每天涂抹小鼠皮肤2次,6周结束实验并测定SOD活性、Hyp含量、MDA含量水平变化。结果鹿角盘胶原蛋白含量为22.46%。鹿角盘胶原肽最优制备工艺为酶解时间2.2 h、pH值为8.0、温度50℃、加酶量1 200μ/g,此条件下的蛋白水解度为15.97%。浓度达到50 g/L时,鹿角盘胶原肽具有最强的抗氧化及还原能力。与空白组比较,胶原肽低、中、高剂量组均有显著的护肤作用,SOD和Hyp水平显著升高(P<0.01),MDA水平显著降低(P<0.01)。结论试验优化的酶解提取工艺条件稳定可行,鹿角盘胶原肽具有较好的护肤作用。

梅花鹿鹿角盘活性肽的分离鉴定及其抑菌活性分析

【目的】分离和鉴定梅花鹿鹿角盘活性肽,并研究其抑菌活性,为其制备和开发利用提供参考。【方法】利用酸提醇沉法从梅花鹿鹿角盘粉末中提取总蛋白,过0.45μm滤器后,用凝胶过滤层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法,从鹿角盘总蛋白中分离、纯化天然活性肽,利用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)方法对其进行鉴定,通过二倍稀释法分析天然活性肽对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌质量浓度(minimal inhibit concentration,MIC);在此基础上,以不添加活性肽的菌悬液为对照,用不同质量浓度的天然活性肽处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,检测菌液的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性和电导率,分析天然活性肽对病原菌菌体生长曲线以及细胞壁和细胞膜的影响。【结果】从梅花鹿鹿角盘总蛋白中成功分离出纯度为93.70%的天然活性肽,其相对分子质量为4543.14,序列与抗菌肽(UNIPORT:A8QJ91)相似,并将其命名为梅花鹿鹿角盘活性肽(sika antler plate bioactive peptide,SAPBP)。SAPBP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度分别为0.5和1 mg/mL,对以上2种病原菌的生长曲线有明显影响。与对照相比,不同质量浓度SAPBP作用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体后,碱性磷酸酶活性和菌液电导率均明显上升,可知SAPBP对病原菌菌体细胞壁和细胞膜造成不同程度的损伤,其中2 MIC SAPBP对病原菌的破坏作用最为明显。【结论】从梅花鹿鹿角盘总蛋白中分离纯化出了天然活性肽,该活性肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。