一种乙型肝炎病毒核酸PCR定量检测试剂的性能验证

目的验证和评价一种乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)定量PCR检测试剂的性能。方法根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)EP系列文件和ISO15189:2012的相关要求对试验试剂的精密度、正确度、可报告范围、定量检测限进行评价。结果精密度:高值(106 IU/mL)、低值(103 IU/mL)标本检测浓度对数值的批内变异系数(CV)分别为3.27%、4.00%,批间CV分别为4.84%、4.89%;正确度:试验试剂与比对试剂具有较好的相关性,直线回归方程为Y=1.006 2 X+0.226 4,r2=0.984 7>0.95;可报告范围:试验试剂在4.76×102~4.76×108 IU/mL范围内具有良好的线性(Y=0.995 9 X+0.183 9,r2=0.999>0.95);定量检测限为500IU/mL。结论试验试剂的各项检测性能与厂家声明相符。

DA3200-ABI7500全自动核酸提取平台高敏HCV RNA定量检测性能验证

目的验证DA3200-ABI7500全自动核酸提取高敏检测HCV RNA方法性能。方法参考美国临床实验室标准化协会批准指南(CSLI-EP),采用DA3200全自动核酸提取平台及荧光定量PCR检测HCV RNA,评价检测方法的核酸提取纯度、精密度、正确度、线性范围、分析灵敏度、特异度和抗污染能力等性能指标。结果核酸提取后A260nm/A280nm比值为2.02。高、低两个浓度样本的批间精密度和批内精密度CV值均≤5%。正确度与抗干扰能力方面,标本实测值与靶值之间的偏离度≤±0.4lg。在13~1.3 E+06 IU/ml范围内,检测结果与靶值有良好的线性关系(Y=0.984X-0.186,r^2=0.998)。最低检出限为20 IU/ml的检出率为100%,且系统具有较强的特异度和抗污染能力。结论基于DA3200-ABI7500全自动核酸提取高敏检测HCV RNA各项分析性能指标均较好,高敏检测对治疗过程的监测及治疗终点判定具有重要意义。

破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2的真核表达及多克隆抗体制备

目的:为了获得真核表达的重组蛋白OCILRP2-Fc和OCILRP2特异性抗体,用于OCILRP2生物学功能的进一步研究。方法:构建了融合人IgG Fc段的小鼠OCILRP2真核表达载体pIg-CD5-OCILRP2,将pIg-CD5-OCILRP2转染CHO细胞,G418筛选稳定表达细胞株;Protein A亲和层析从CHO细胞培养上清中纯化重组蛋白OCILRP2-Fc并免疫家兔制备OCILRP2多克隆抗体。ELISA检测抗血清和多克隆抗体的效价,Western blot验证多克隆抗体的特异性,并应用该抗体检测OCILRP2在树突状细胞(Dendritic cells,DC)中的表达。结果:ELISA结果表明OCILRP2-Fc稳定表达细胞株经过多次传代培养后仍然具有较高的蛋白表达水平;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化后的蛋白只有单一条带出现,且该条带可以被抗人IgG检测到;重组蛋白OCILRP2-Fc免疫家兔获得的抗血清和纯化后得到的OCILRP2多克隆抗体效价分别为1∶1 280 000和1∶320 000,Western blot证明该抗体可以和免疫原OCILRP2-Fc及NIH/3T3细胞中表达的OCILRP2特异性结合。应用该抗体检测OCILRP2在DC的表达发现OCILRP2在成熟DC的表达明显高于不成熟DC。结论:获得了真核表达的重组蛋白OCILRP2-Fc和高效价的OCILRP2特异性抗体,为进一步研究OCILRP2在免疫应答中的功能奠定了基础。

复方苦参注射液联合奥沙利铂对结肠癌干细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响

目的:探究复方苦参注射液联合奥沙利铂对结肠癌干细胞(cCSCs)增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法:采用无血清培养从结肠癌SW480细胞系中获得cCSCs,并将其分为对照组、复方苦参注射液组、奥沙利铂组、联合组,CCK-8法检测药物对cCSCs存活率的影响;流式细胞仪分析用药后cCSCs细胞凋亡情况;qPCR和Western Blot检测用药后cCSCs细胞周期和凋亡相关基因及蛋白的表达。结果:复方苦参注射液组、奥沙利铂组cCSCs存活率均显著低于对照组,联合组效果较单药组显著(P<0.05),两药具有协同作用。两药单用与联用均能显著诱导cCSCs细胞凋亡,降低Cyclin D、Bcl-2 mRNA及蛋白表达,升高P21、P27、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达(P<0.05)。联合用药的作用显著优于单独用药(P<0.05)。结论:复方苦参注射液与奥沙利铂具有协同作用,可抑制cCSCs增殖,通过影响细胞周期和细胞凋亡相关基因及蛋白表达调控细胞周期,诱导细胞凋亡。

抗乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原McAb的特性分析与初步应用

目的:通过对抗乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原单克隆抗体的特性分析,研制检测乙型副伤寒沙门菌的ELISA法,对副伤寒传染病进行早期诊断。方法:用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并进行鉴定,用双抗体夹心ELISA建立检测乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原ELISA方法,对临床标本进行检测。结果:7株抗乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原的单克隆抗体IgG15株、IgG2 a 1株、IgG2b 1株,均不与相关沙门菌、肠道菌反应,用菌体免疫制备的M cAb 3B5、3G12、7H1、2B5,与乙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原反应,而用纯化的鞭毛抗原免疫制备的单克隆抗体1F4、5D3、3H7,只与乙型副伤寒沙门菌鞭毛抗原,3B5与7H1识别同一抗原表位,3B5、7H1与3G12、2B5相互识别不同抗原表位,1F4、5D3、3H7相互识别不同抗原表位。3B5包被、过氧化物酶(HRP)标记3G12建立双抗体夹心ELISA,鞭毛抗原、菌体的最低检出量分别为5 ng/m l、105个/m l。检测159份献血员血清及70份发热待查血清为阴性,1份发热待查血清、9份血培养阳性患者血清为阳性。结论:用纯化的鞭毛抗原免疫制备的单克隆抗体不适于检测乙型副伤寒沙门菌,菌体免疫制备的单克隆抗体特异性强,建立的双抗体夹心ELISA法,可对乙型副伤寒进行早期诊断。

食品中沙门菌的检测

目的:检测超市奶类和肉类制品中沙门菌的污染情况,初步评价检测食品中沙门菌的检测方法。方法:样品经增菌后,用科玛嘉显色培养基培养、ELISA法、国标法对超市的奶类和肉类制品中的沙门菌进行平行检测,并对其灵敏性和特异性、符合率进行比较分析。结果:检测320份奶类制品和肉制品,科玛嘉显色培养基培养、ELISA法、国标法阳性样品数分别为23份、26份、20份,其阳性率分别为7.2%、8.1%、6.3%。科玛嘉显色培养基培养的敏感性和特异性分别为100%、99%,与国标法的符合率达99.1%。ELISA法的敏感性和特异性分别为100%、98%,与国标法符合率98.1%。ELISA法与科玛嘉显色培养基培养的符合率为99.1%。157份奶类制品,科玛嘉显色培养基培养、ELISA法、国标法检测阳性样品数分别为6、6及5份,阳性率分别为3.8%、3.8%和3.2%,有2份检测结果不一致。163份肉类制品,阳性样品分别为17、20、15份,阳性率分别为10.4%、12.3%和9.2%,有5份肉食品检测结果不一致。结论:科玛嘉显色培养基培养、ELISA法和国标法对超市的奶类和肉类制品中的沙门菌进行平行检测,符合率高。利用科玛嘉显色培养基培养、ELISA法,可以快速、方便地对食品中沙门菌的污染进行批量初筛,科玛嘉显色培养基鉴别培养特异性好,更适合食品沙门菌的分离与初筛检测。

结直肠癌患者中医证型和细胞免疫功能的相关性分析

目的探讨结直肠癌(CRC)患者中医虚实证型与细胞免疫功能之间的关系,明确中药联合化疗治疗对CRC患者免疫功能的影响.方法收集2017年1月~2017年12月陕西中医药大学附属医院肿瘤科95例CRC住院患者,将其辨证分型分为实证(热毒蕴结证)、虚实错杂证(气滞血瘀证)和虚证(气阴两虚证).检测T细胞亚群(CD3^+、CD3^+ CD4^+、CD3^+ CD8^+、CD4^+/CD8^+)、B细胞、NK细胞百分比细胞免疫功能指标,分析CRC患者中医证型与免疫功能指标之间的关系.经过半年中药联合化疗治疗后,观察CRC患者免疫功能指标的变化.结果95例CRC患者外周血CD3^+ T细胞百分比实证组>虚证组,差别具有统计学意义(P<0.05).外周血CD3^+ CD4^+ T细胞百分比实证组>虚证组、虚实错杂组>虚证组,差别具有统计学意义(P<0.05).患者外周血CD4^+/CD8^+细胞比值虚实错杂组>实证组,虚实错杂组>虚证组,差别具有统计学意义(P<0.05).患者外周血NK细胞百分比虚证组>实证组,差别具有统计学意义(P<0.05).治疗后,气阴两虚证(虚证)患者CD3^+ T细胞(t=-4.740,P=0.000)、CD3^+CD4^+T细胞(t=-3.084,P =0.006)明显上升,有统计学意义.结论虚证CRC患者的免疫细胞功能被显著抑制,中药联合化疗治疗可显著提高CRC患者的细胞免疫功能.

长链非编码RNA在结直肠癌中的研究进展

结直肠癌(CRC)是全球第三大恶性肿瘤。长非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200个核苷酸的不编码蛋白质的RNA。各种疾病中lncRNA的异常表达通过不同方式参与其增殖、凋亡、转移和分化等。在CRC也发现了lncRNA的异常表达。本文阐述了不同lncRNA在CRC中的作用,以及它们临床应用的潜在价值。

高敏乙型肝炎病毒核酸定量检测系统的性能验证

目的验证DA3200-ABI7500全自动核酸检测平台高敏乙型肝炎病毒(HBV)-DNA定量检测性能。方法参考美国临床实验室标准化协会批准指南(CSLI-EP),通过定量检测HBV-DNA评价检测方法的精密度、正确度、线性范围、最低检出限、抗干扰能力和抗污染能力性能指标。结果精密度:高、低2个浓度样本的批间和批内精密度变异系数(CV)均≤5%;正确度:对5例国家卫健委临检中心室间质评样本和4例标准物质检测,实测值与靶值之间的偏差均≤±0.41 g;线性范围:对9个浓度的线性样本进行测定,线性范围为19.5^(1.95×109)U/mL,线性方程:Y=0.156 7+1.004 8 X(b=1.004 8,R2=0.999 6);检测能力方面,验证该系统的最低检出限为20 U/mL;抗干扰能力方面,对含20 g/L血红蛋白、300 mg/L胆红素、30 000 mg/L甘油三酯的样本进行检测,实测值与预期值之间的偏差≤±0.41 g;抗污染能力方面,高浓度阳性样本和阴性样本间隔放置,检测结果均符合预期。结论基于DA3200-ABI7500全自动核酸检测平台的高敏HBV-DNA定量检测各项分析性能指标均较好,可为临床提供更加可靠、准确的数据。

北柴胡达玛烯二醇合成酶基因克隆及表达分析

目的克隆北柴胡Bupleurem chinense达玛烯二醇合成酶(dammarenediol synthase,DS)基因BcDS,并进行生物信息学及表达模式分析。方法通过搜索转录组数据库,利用RT-PCR克隆开放阅读框(open reading frame,ORF)和启动子区。通过生物信息在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、结构域、信号肽、三级结构等分子特征,利用Jalview软件进行氨基酸多序列比对,采用MEGA 11.0软件进行分子进化分析。运用实时荧光定量PCR检测基因表达模式。结果BcDS ORF长2115 bp,编码的蛋白包涵704个氨基酸,相对分子质量为80770,为酸不稳定的亲水蛋白,无跨膜结构域或信号肽。BcDS与人参、西洋参等植物DS的相似性高,具有达玛烯二醇合成酶特征结构域,且BcDS与人参、西洋参、三七等DS聚为一支。BcDS启动子区域含有响应环境及植物激素的顺式作用元件。BcDS在根中的表达量最高,分别为茎、叶和花中BcDS表达量的5.81、10.44和7.86倍,并受茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和水杨酸(salicylic acid,SA)的显著诱导。结论获得北柴胡BcDS基因序列特征,明确了BcDS根中高表达且受MeJA和SA诱导表达,为进一步研究基因在柴胡皂苷合成中的分子作用奠定基础。

桥梁大体积混凝土水化热及管冷仿真技术

应用大型有限元软件分析桥梁承台施工中管冷的作用,通过有管冷、无管冷和降低管冷温度模拟大体积混凝土降温的效应。根据湖北十堰地区某大桥承台施工中的真实记录,证明文中的仿真分析是正确的,所得结论对类似工程具有较大的参考价值。

结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6的串联表达及其免疫原性研究

目的表达并纯化ESAT6c2融合蛋白,并对融合蛋白免疫原性进行鉴定,以用作结核菌特异性IFN-γElispot试剂盒的特异性抗原。方法全基因合成ESAT6目的基因,利用Bam HⅠ和BglⅡ同尾酶串联目的基因,构建ESAT6c2-p ET25b重组质粒,转化E.coli,诱导表达。Ni柱亲和纯化融合蛋白,测定浓度后应用到T.SPOT-TB试剂盒(Oxford)检测临床样本进行免疫原性研究。结果成功构建了ESAT6串联表达重组质粒,制备出高纯度的ESAT6c2融合蛋白。临床样本检测结果表明ESAT6c2融合蛋白作为刺激源,与临床诊断相比特异性为100%(20/20),灵敏度为84.61%(33/39);与T.SPOT-TB试剂盒TA检测孔有较强一致性(Kappa=0.932)。稳定性研究也表明,ESAT6c2融合蛋白经加速破坏试验后,与临床诊断相比特异性为100%(20/20),灵敏度为84.38%(27/32);依然与TA检测孔有较强一致性(Kappa=0.923)。结论 获得的高纯度ESAT6c2融合蛋白,可以应用于结核菌特异性IFN-γElispot试剂盒。

人重组催乳素蛋白的原核表达、纯化及其稳定性分析

目的表达并纯化重组人催乳素(prolactin,PRL)蛋白,并检测其抗原性及稳定性。方法以商品化的PRL c DNA为模板,PCR扩增目的基因,定向克隆至质粒p ET25中,构建重组原核表达质粒PRL-p ET25b,转化大肠埃希菌后诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE鉴定后,采用Bradford法测定蛋白浓度,PRL定量试剂盒分析抗原性,置-20、4和37℃9 d后,分析稳定性。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组PRL蛋白相对分子质量约30 000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%,纯度大于90%,总蛋白浓度为0.796 mg/ml。重组PRL蛋白于-20、4和37℃放置9 d,浓度变化较小,偏差在10%以内。结论获得了高纯度的重组PRL融合蛋白,抗原性及稳定性均较好,可应用于试剂盒标准品或校准品的制备。