甲氧基聚乙二醇遮蔽猕猴红细胞表面类人B抗原的研究

目的 观察mPEG对猕猴类人B抗原的修饰效果及mPEG修饰后的红细胞给动物输血的安全性。方法 用 3mg/ml的mPEG修饰遮蔽猕猴红细胞表面的类人B血型抗原 ,吸收放散法检测猕猴血型及mPEG对猕猴红细胞血型的修饰结果 ;红细胞变形仪等检测mPEG修饰对红细胞的变形能力、结构与功能的影响 ;荧光素标记 ,自体回输实验检测红细胞存活率 ;异体回输实验观察修饰后红细胞对受血猴的血液、尿液的影响。结果 mPEG修饰可以遮蔽猕猴类人B抗原的抗原性 ,不影响所修饰红细胞结构、功能及体内存活 ;mPEG修饰的类人B型红细胞输给类人A型血的猕猴 ,未发生输血反应 ;受血猴的血细胞、血液生化及尿液各项指标与输血前相比 ,无明显变化。结论 mPEG修饰可遮蔽猕猴红细胞表面类人B抗原的抗原性 ,mPEG修饰红细胞在受血猴体内是安全的。

小分子糖负载血小板+冻干保护剂混合悬液的相变点测定与屏蔽实验研究

目的测定冻干血小板长期保存预冻程序和所依据的制品相变点温度并摸索相应屏蔽相变点的最佳冷冻曲线。方法研制出小分子糖负载血小板+冻干保护剂混合悬液,使用速率程序降温仪分析测定该混合悬液样品的相变点温度;根据测得的相变点温度,设计屏蔽相变点的预冻程序,根据温度变化曲线,判断相变点屏蔽结果。结论该混合悬液样品的相变点温度为(-13.56±2.05)℃;据此相变点温度所设计的3种相应的屏蔽相变点的预冻程序中,程序3为最佳冷冻曲线。结果获得了小分子糖负载血小板+冻干保护剂混合悬液的相变点温度及相应的屏蔽相变点的最佳预冻程序。

甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰遮蔽人ABO血型抗原

输血是一种非常有效的临床治疗手段 ,但血型不符会造成输血死亡事故 .为了解决输血中存在的血型匹配困难等问题 ,使用甲氧基聚乙二醇 (mPEG)化学修饰法 ,对红细胞表面的血型抗原进行化学修饰 ,从而达到遮蔽红细胞血型抗原的目的 .通过对mPEG BTC、mPEG ALD和mPEG 2 NHS三种mPEG衍生物对红细胞A抗原和B抗原修饰效果的比较 ,结果表明mPEG BTC修饰效果最好 ,可以完全遮蔽红细胞的A抗原和B抗原 ,使修饰后的A型、B型和AB型红细胞呈现出与O型红细胞相同的血型血清学特征 ;进一步研究证明 ,mPEG BTC与红细胞结合牢固 ,对红细胞结构、功能、变形能力、常规指标和沉降率等基本没有影响 .初步实现了A→O ,B→O和AB→O的血型改造 ,从而为临床输血治疗遇到的偏型、稀有血型、配型困难等问题的解决 ,提供了新的技术方法与思路 .

猪红细胞血型抗原修饰异种输血的研究进展

异种器官移植所取得的突破性进展为异种输血的研究带来了曙光。人与猪的红细胞的血清学和生物化学特性有许多相似之处 ,因此猪就成为实现异种输血最具可能性的红细胞供体。猪红细胞上存在异种抗原 ,包括αGal抗原和non αGal抗原。αGal抗原和人血清中天然存在的抗αGal抗体结合后引起的免疫排斥反应在抗体介导的凝集反应中起主要作用。但是non αGal抗原和人血清中天然存在的抗non αGal抗体结合引起的免疫排斥反应作用也不能低估。经特定修饰、改造以后的猪红细胞 。

生物化学稳定法冰冻干燥血小板制剂的功能研究

目的对生物化学稳定法——小分子糖稳定法冻干的血小板的功能进行分析研究,进一步验证此种方法保存的血小板的质量。方法采用小分子糖负载的方法对血小板进行预处理保护后冻干;通过细胞计数的方法测定细胞回收率、诱导聚集试验测定血小板冻干制剂的聚集活性、血小板Ⅲ因子有效性试验检测冻干血小板的Ⅲ因子活性;通过动物实验,观察小分子糖稳定法冻干的血小板是否具有缩短实验动物的静脉出血时间的作用。结果小分子糖稳定法冻干的血小板细胞回收率为70%;ADP诱导的聚集活性可达新鲜血小板的50%以上;THR诱导的聚集活性99.9%;缩短实验小鼠的尾静脉出血时间。结论生物化学稳定法冻干的血小板保留了初期止血功能。

猪红细胞表面抗原化学修饰后应用于异种输血的初步体外研究

目的使化学修饰的猪红细胞(pRBC)呈现出与人红细胞(hRBC)相似的血清学特性,减弱或消除人体对pRBC的免疫排斥。方法采用双修饰法即rSα-GalE酶解法(100U/mL的rSα-GalE处理)修饰改造pRBC表面的Gal抗原,再用mPEG包裹法(3mmol/L的mPEG-BTC)修饰遮蔽pRBC的non-αGal表面抗原。结果修饰后的pRBC与人混合血浆的盐水交叉配血试验为阴性;修饰后pRBC的结构、功能等指标基本正常。结论经rSα-GalE和mPEG双修饰法修饰改造的pRBC呈现出与hRBC相似的血清学特性。

牛、猪红细胞表面异种抗原改造的比较

把动物红细胞输用给人,即异种输血,可以缓解目前血源紧张的矛盾,但牛和猪的红细胞与人的血浆发生强烈的凝集反应,不能直接输用。本研究首次对牛和猪红细胞表面抗原进行修饰改造,并对改造后的猪、牛红细胞进行比较,从而为开拓丰富来源、安全有效的人血代用品奠定基础。使用基因重组的咖啡豆α半乳糖苷酶清除牛和猪红细胞表面的主要异种抗原αGal抗原,结合使用化学材料甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰遮蔽牛和猪红细胞表面的非主要异种抗原nonαGal抗原,以实现对牛和猪红细胞表面异种抗原的改造。结果:改造后的牛、猪红细胞与人混合血浆的盐水凝集反应消失,具有和人红细胞相似的血清学特征;牛红细胞比猪红细胞脆性低,异种抗原的表达量低,及其他的一些特征说明牛红细胞比猪红细胞更适合作为人红细胞代用品。结论:改造后的牛红细胞与人血浆相匹配,有可能成为人红细胞代用品。

海藻糖抑制高浓度葡萄糖诱导的红细胞磷脂酰丝氨酸暴露、渗透脆性增高和膜脂质过氧化损伤的研究

尽管高浓度葡萄糖孵育有利于深低温或冰冻干燥保存人红细胞的存活,但是高浓度葡萄糖仍然对红细胞造成一定损伤。本研究探讨海藻糖对高浓度葡萄糖导致的红细胞损伤的影响。将红细胞于含有一定浓度海藻糖的葡萄糖缓冲液中孵育3小时后,用流式细胞术分析红细胞磷脂酰丝氨酸(PS)分布和细胞渗透脆性,用TBA法检测膜脂质过氧化损伤。结果表明:葡萄糖可以导致红细胞PS暴露、脂质过氧化损伤和细胞渗透脆性增高,而且其效率和葡萄糖浓度和温度密切相关。然而,海藻糖却可以很好地抑制高浓度葡萄糖诱导的红细胞PS暴露、渗透脆性增高和过氧化损伤。随着海藻糖浓度的增加,红细胞PS标记率、丙二醛(MDA)浓度和细胞碎片率呈逐步下降的趋势。结论:高浓度葡萄糖可以导致细胞PS暴露、脂质过氧化损伤和渗透脆性增高,而且这3种损伤之间存在一定关系;海藻糖可以有效地抑制高浓度葡萄糖导致的红细胞PS暴露、渗透脆性增高以及过氧化损伤,这对于应用小分子糖类保存红细胞研究具有重要意义。

负载表没食子儿茶素没食子酸酯对血小板功能与凋亡等影响

本研究探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)负载后对血小板生理生化功能的影响。将血小板用不同浓度EGCG(浓度分别为:0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、20、30mmol/L)的负载液处理,通过比对回收率和聚集活性,将实验分为2.5、5、10mmol/L负载液处理组和空白对照组,观察保存期内血小板生理生化功能的改变;血小板的回收率通过血细胞计数技术仪进行检测;血小板聚集活性通过比浊法测定;流式细胞术检测血小板的凋亡。结果表明,负载液中EGCG浓度为2.5、5、10mmol/L时负载入血小板的EGCG量分别为0.4006±0.12、1.0527±0.1503、1.6902±0.1112mmol/L。当负载液中EGCG浓度较低时(<15mmol/L),负载液中EGCG的浓度与血小板对EGCG的吸收量呈正相关。检测血小板回收率时发现,2.5mmol/L的负载液处理组回收率为(82.45±0.360)%,空白组为(90.33±1.115)%,负载EGCG血小板回收率下降(p<0.05);比较而言,回收率在5mmol/L组和10mmol/L组分别为(57.51±2.468)%和(47.45±2.030)%,下降更为明显(p<0.01)。当使用ADP作为诱聚剂时,空白对照组中血小板的最大聚集率(MAR)为(63.6±4.037)%,高于其它组(p<0.01),血小板的聚集活性与负载液的EGCG浓度呈明显的负相关。当使用THR作为诱聚剂时,对照组的MAR为(89.3±6.533)%,高于EGCG负载的实验组(p<0.05),其中10mmol/L EGCG负载液的血小板聚集活性为(70.1±5.400)%,受到的影响较为显著(p<0.01)。在细胞凋亡检测实验中发现,负载EGCG后的血小板容易呈现早期凋亡状态,说明EGCG对于血小板的程序性死亡有一定的促进作用。结论 :负载入血小板中的EGCG对血小板各种生理功能有着明显的影响,负载EGCG后的血小板更易发生细胞程序性死亡。

建立人/猪造血嵌合体模型的初步探讨

本研究目的是利用免疫系统尚未成熟的胎猪和新生猪作为人脐血造血干细胞(HSC)的移植受者,建立人/猪造血嵌合体模型,初步探讨在猪体内扩增HSC的可行性。在无菌隔离器中,通过肌肉或脐静脉(剖子宫)给胎猪移植人脐血细胞,或在断脐前通过脐静脉给新生猪移植人脐血细胞,应用流式细胞术检测移植组猪外周血中人CD45+细胞。结果表明:移植后,受试猪生长发育与对照猪一致;移植后60天时,用流式细胞术在猪的外周血中检测到一定比例的人源细胞。结论:胎猪或新生猪能耐受一定量的人源抗原的植入,建立人/猪造血嵌合体模型是可行的。

甲氧基聚乙二醇修饰人红细胞血型抗原的研究

红细胞输注是输血医学的主体,化学材料甲氧基聚乙二醇(mPEG)与红细胞膜共价结合后,可遮蔽红细胞表面血型抗原,使红细胞血型抗原呈阴性,即形成通用型红细胞,对临床输血具有重要意义。研究了mPEG修饰对红细胞血型抗原、膜流动性的影响;红细胞被修饰程度;mPEG与红细胞结合的稳定性;mPEG在体内的代谢情况。结果表明,mPEG能遮蔽红细胞上的血型抗原;mPEG与红细胞结合稳定;mPEG修饰红细胞的比率随浓度增高而增大;mPEG在小鼠体内24 h后基本被代谢,且在体内无蓄积。mPEG修饰的红细胞为解决临床急用稀有血型和配型困难(如自身溶血性贫血,AIHA)等问题提供了有意义的参考。

冻干血小板对大鼠难愈合创伤模型的实验治疗

血小板含有20多种生长因子,对于创伤尤其是难愈性创伤具有治疗作用。本研究以糖尿病SD大鼠为基础,建立了一种难愈合创口模型,用于评价冻干血小板对难愈性创伤修复的治疗作用。采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)65mg/kg对大鼠腹腔注射制备糖尿病模型。取正常大鼠10只,糖尿病大鼠20只,将其分为正常对照组(NDR)、糖尿病对照组(DR)和冰冻干燥血小板治疗组(TLP);在各组大鼠背部造成直径2cm圆形创面,分别于第l、3、5、7、12天进行创面照相和透明膜描计法计算创面愈合速度。结果显示,注射STZ72小时后糖尿病组血糖明显高于16.7mmol/L。1周后糖尿病大鼠体重与正常对照组比较明显减轻(p<0.05)。糖尿病对照组创口的愈合速度在各个时间点均低于正常对照组创口(p<0.05),冰冻干燥血小板治疗组创口愈合速度显著快于糖尿病对照组。第12天时,正常对照组和治疗组创口再上皮化率分别达到88.1%和81.8%,而糖尿病组只有62.8%。结论 :以链脲佐菌素建立的糖尿病大鼠能成功制备难愈合创口模型,冰冻干燥血小板对该难愈性创伤模型具有治疗作用。

玻璃化深低温保存小鼠卵巢组织的研究

对小鼠卵巢组织进行玻璃化深低温保存的初步研究,探索合适的玻璃化保护剂及保存方法。取3周龄小鼠卵巢组织,采用不同保护剂进行玻璃化深低温保存,-196℃液氮保存一周后复温,进行组织切片HE染色观察,筛选合适的玻璃化保护剂;对保存后的小鼠卵巢组织进行自体移植体内培养2周后,取出卵巢组织进行形态学观察及基因表达研究,采用RT-PCR方法检测到了在原始卵泡向初级卵泡发育过程中特异表达的AMH基因及在各个阶段的卵泡中均表达的KL基因。结果表明采用高浓度渗透性保护剂(二甲基亚砜、乙酰胺、丙二醇)的玻璃化保护液对小鼠卵巢组织保存效果较好,说明采用玻璃化技术保存卵巢组织的方法可行,并可采用检测基因表达的方法验证深低温保存卵巢组织的效果。

富血小板血浆应用于创伤修复的研究进展

血小板来源的生长因子作为一种生物活性物质,可以增强诸如趋化、细胞增殖、血管生成和细胞外基质沉积等创伤修复。富血小板血浆(PRP)是通常的血小板应用形式,激活后形成血小板胶,并释放包括PDGF、TGF、VEGF、IGF和EGF等在内的大量生长因子,对细胞的分化和有丝分裂活性产生极大的影响,并伴随整个创伤修复期。本文就富血小板血浆应用于创伤修复的理论基础和作用机制进行了总结,同时概述了有代表性的临床案例,并对这个创伤修复新方法的应用前景进行了分析和展望。

小分子糖类负载后血小板超微结构和功能初步研究

本研究探讨血小板在37℃条件下负载小分子糖类物质4小时后形态、结构和功能的变化。应用透射电子显微镜观察小分子糖类物质负载前后血小板超微结构的变化,用血细胞计数仪检测血小板数及血小板平均体积(MPV)的变化,用血小板聚集测试仪检测血小板最大聚集率,采用流式细胞术检测血小板膜表面标志CD62p及磷脂酰丝氨酸(PS)。结果表明:小分子糖类物质负载后,血小板超微结构无明显变化;血小板最大聚集率可达新鲜血小板的60%以上;血小板计数和血小板平均体积(MPV)与新鲜血小板相比无显著差异(p>0.01);血小板膜表面标志CD62p的标记率及Annexin V的结合率与新鲜血小板相比均无明显差异。结论:小分子糖类物质负载后血小板仍然具有相对完整的超微结构和较好的聚集活性,功能基本正常。

甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD(+)血型的初步研究

Rh血型与ABO血型一样是重要的血型系统 ,Rh血型不符会引起严重的输血反应及新生儿溶血病。中国人群中RhD阴性血型的比例仅为 0 .2 % - 0 .5 % ,将RhD阳性红细胞改造成RhD阴性红细胞在临床输血中有重要的意义。本研究用 4种不同端基的甲氧基聚乙二醇 (mPEG) ,修饰A型、B型、AB型和O型的RhD( + )红细胞 ,比较 4种mPEG衍生物对RhD抗原的修饰效果。同时观察mPEG修饰对红细胞形态、结构和功能的影响。结果表明 ,mPEG BTC(苯并三唑端基PEG)较其他 3种PEG的修饰效果好 ,在 1mmol/L时可以有效地遮蔽红细胞表面RhD抗原 ,而对红细胞形态、渗透脆性、自身溶血、乙酰胆碱酯酶、胆固醇、ATP、2 ,3 DPG含量以及变形性无影响。结论 :初步实现了将RhD( + )红细胞修饰改造成RhD( - )红细胞的目的。

冰冻干燥血小板应用于创伤修复的研究

目的探讨冰冻干燥血小板对创伤修复的促进作用。方法建立大鼠全层皮肤缺损创伤模型,创伤分未治疗组、rhPDFGF治疗组、新鲜血小板治疗组和冰冻干燥血小板治疗组处理;测定再上皮化速率;组织学标本的采集与处理;苏木精-伊红(HE)染色;复疫组织化学染色。观察它们对创伤修复的促进作用。结果各治疗组均可促进创伤修复,治疗组与未治疗组相比差异均具有统计学意义(P<0.01),新鲜血小板治疗组与冰冻干燥血小板治疗组粗创伤修复效果无统计学意义(P>0.05),但都显著优于rhPDGF治疗组(P<0.01)。结论冰冻干燥血小板具有与新鲜血小板相同的促创伤修复效果,并且优于相同剂量的单一生长因子PDGF-BB。

血小板功能检测的研究进展

血小板在执行生理性止血的同时,也在病理性血栓形成过程中起重要作用。血小板功能检测对于临床相关疾病的诊断和抗血小板药物的筛选及相关研究有着重要的意义。目前,血小板功能检测的实验与方法日益增多,但所有这些检测方法均有不足之处,因而有必要研究和发展一种操作简便、检测灵敏度高的方法。本文对近年来血小板功能检测方法诸如血小板的一般功能检测、血小板黏附功能测定、血小板聚集功能测定、血小板释放功能测定、血小板凝血活性检测和流式细胞术在血小板功能检测中的应用等研究进展进行了综述,并对研究前景作了简单的展望。

化学材料修饰红细胞非ABO系统血型抗原的研究

目的 考察甲氧基聚乙二醇 (mPEG)衍生物与红细胞膜蛋白共价结合 ,遮蔽红细胞上的非ABO系统的血型抗原的效果。方法 选择 3种端基的mPEG衍生物 (mPEG BTC、 NHS、 ALD)修饰红细胞 ,分别观察它们对红细胞抗原性、形态结构及功能的影响。结果 携带BTC端基的mPEG遮蔽抗原效果较好 ,并对红细胞结构、功能、变形性无影响 ;而且修饰后的红细胞无叠连现象 ,红细胞沉降率 (ESR)有所降低。结论 mPEG修饰后的红细胞在解决临床输血中经常遇到的偏型、血型。