稻瘟病菌热激蛋白(HSP)40编码基因MoMHF6的鉴定及功能研究

【目的】探明稻瘟病菌热激蛋白(HSP)40在形态分化和致病过程中的作用。【方法】利用DNA同源重组方法敲除了稻瘟病菌HSP40编码基因MoMHF6,获得ΔMomhf6突变体,并通过表型分析、基因回补、RNA-seq分析等对MoMHF6的生物学功能进行较系统的研究。【结果】敲除MoMHF6基因导致稻瘟病菌气生菌丝生长、无性产孢、孢子萌发、子囊壳产生和附着胞形成均显著下降,但与野生菌株相比,ΔMomhf6突变体在CM培养基上的径向生长没有显著差异,在子囊壳中仍可形成子囊和子囊孢子。在1、2和3 mol/L甘油溶液处理条件下,ΔMomhf6突变体附着胞塌陷率显著升高,说明MoMHF6与附着胞膨压形成有关。ΔMomhf6突变体对洋葱内表皮的穿透能力和对感病寄主的致病性完全丧失,甚至在划伤大麦叶片表皮组织中的扩展也受明显限制。而且,ΔMomhf6突变体对氧化胁迫的敏感性增强,附着胞发育过程中糖原的转运和降解缓慢,说明MoMHF6参与氧化胁迫反应和附着胞的糖原代谢。将完整的MoMHF6基因重新导入ΔMomhf6突变体可回补突变体的所有表型缺陷。另外,RNA-seq分析显示,部分已知的稻瘟病菌致病相关基因表达可能受MoMHF6调控,如MoATG4、MoPL1、MoVPR和GAS1等。【结论】综上所述,稻瘟病菌HSP40编码基因MoMHF6在产孢、附着胞形成、穿透寄主、氧化胁迫应答、致病等过程中起重要作用,研究结果对进一步阐明MoMHF6调控稻瘟病菌形态分化和致病过程的基因网络和分子机制具有重要意义。

浙江小麦根围土壤腐霉（Pythiumspp．）的一些生态学研究

本文对小麦根围土壤中的腐霉Ｐｙｔｈｉｕｍ种类、种群数量消长及其致病性作了初步研究。作者从不同生育期的小麦根围和内根围共分离出２０３个腐霉菌株，除６９个菌株缺乏产生有性器官而未能鉴定外，其余１３４个菌株分别属１０个腐霉种，其中粘腐霉Ｐ．ａｄｈａｅｒｅｎｓ、链状腐霉Ｐ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ和绚丽腐霉Ｐ．ｐｕｌｃｈｒｕｍ为浙江省分布新记录。Ｐ．ｓｐｉｎｏｓｕｍ是优势腐霉种类，在小麦根围和内根围出现率分别为２７．４３％和３５．７１％，Ｐ．ｕｌｔｉｍｕｍ和Ｐ．ｉｒｅｇｕｌａｒｅ也较为常见，而Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ却极少出现。在小麦苗期和分蘖期腐霉数量较丰富，生育中后期较贫乏，这一消长变化可能主要与小麦生育期和土壤温度有关。致病性试验结果表明：Ｐ．ｉｒｅｇｕｌａｒｅ和Ｐ．ｓｐｉｎｏｓｕｍ分别对小麦和水稻有较强的致病作用；Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒ－ｍａｔｕｍ、Ｐ．ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ和Ｐ．ｓｐｉｎｏｓｕｍ则对茄子、辣椒和番茄的致病力较强。Ｐ．ｓｐｉｎｏｓｕｍ、Ｐ．ｕｌｔｉｍｕｍ和Ｐ．ｉｒｅｇｕｌａｒｅ的种内菌株间致病性差异不明显。

根癌土壤杆菌介导的丝状真菌转化

最近研究表明,Agrobacteriumtumefaciens介导转化(ATMT)的方法,可以应用到丝状真菌中。本文将从ATMT的转化原理、转化特点、转化方法以及其在丝状真菌中的主要转化实例四个方面来着重介绍A.tumefaciens介导的丝状真菌转化的最新研究进展。并对其今后的应用前景提出了展望。

尖孢镰刀菌的遗传多态性

尖孢镰刀菌是重要的植物维管束病原真菌。近年来 ,有关该菌的遗传多态性研究报道很多 ,本文着重综述了利用营养体亲和群、DNA多态性技术研究尖孢镰刀菌专化型、小种及其相互关系等方面的进展 ,同时介绍了对棉花枯萎病菌。

尖孢镰刀菌致病菌营养体亲和群研究

在分离、鉴定侵染黄瓜的尖孢镰刀菌的基础上 ,测定 30个尖孢镰刀菌菌株 (包括 6个专化型 )对黄瓜的致病性和营养体亲和性。研究结果表明 ,侵染我国黄瓜的尖孢镰刀菌至少有 5个以上的营养体亲和群 (VCGs) ,除来自黑龙江的 990 9 1菌株与希腊的黄瓜根茎腐专化型 (Fusariumoxysporumf.sp .radicis cucumerinum ,FORC)菌株属同一亲和群外 ,其它菌株均与希腊的尖孢镰刀菌黄瓜专化型 (F .o .f.sp .cucumerinum ,FOC)和FORC不亲和 ,本文所测定的的尖孢镰刀菌非致病菌株均与致病菌株不亲和 ,不同专化型的尖孢镰刀菌菌株归属于不同的营养体亲和群。

防治芦笋茎枯病的药剂筛选及田间防治效果测定

经室内测定二十多种杀菌剂抑制茎枯病菌孢子萌发、菌丝生长以及田间防病的效果，结果指出：低浓度多菌灵等使病菌孢子发芽后的芽管和菌丝致畸，代森锰锌等在较低浓度下可完全抑制孢子萌发，属两类不同的抑菌机制。通过两类药剂的混配，筛选出在室内或田间均具明显增效作用的混配剂－４号，以含药平板法测定抑制菌丝生长的增效值达２．４５，田间初步测定具较好的保护和一定的治疗效果，小区试验的防效，比单一多菌灵超微粉提高了１５．４２％。

菜地土壤及小麦、水稻根围土壤中的腐霉及其种群消长

对杭州市郊菜地土壤、小麦根围土壤及水稻根围土壤中的腐霉种类及消长规律进行了较系统的研究，共分离鉴定了１６个腐霉种，土壤中的腐霉种群数量消长呈明显的季节性，以冬春季为高峰，而夏秋季较少；小麦和水稻根围土壤中的腐霉则与作物生育期有关，作物生育前期腐霉种群数量达到高峰，后期减少。

芦笋茎枯病发生规律及其药剂防治

本文在田间接种条件下研究了芦笋茎枯病发生规律及药剂防治效果。结果表明：在出土二周内芦笋嫩茎的感病性与接种时嫩茎的出土天数呈负相关；茎秆上病斑的高度和分布范围均与接种时茎的出土天数呈正相关；出土后培土比培土后出土的嫩茎发病率高１４．７７％，且后者地下部主茎较少发病，说明土表的菌源及其气传孢子是主要的侵染源。芦笋嫩茎期是施药防治的关键时期，１００００ｍｇ／Ｌ的多菌灵混配制剂表现出较好的治疗和保护作用，而在常规施药浓度（１０００ｍｇ／Ｌ）下效果均不理想。

定量测定土壤腐霉的几种方法和选择性培养基的效果比较

腐霉(Pythium spp.)是最重要的土壤真菌之一,除引起各类农作物的腐烂、猝倒等病害外,也是研究生物进化的好材料,因此倍受植物病理学家、真菌学家和生物系统学家所重视。近20年来,有关土壤腐霉的定量测定及消长规律的研究报道十分普遍。作者将定量分离土壤腐霉的几种方法和选择性培养基的效果进行了比较,现将结果报道如下。材料与方法(一)土样采集和悬浮液制备1.土样采集。选择杭州市郊4块蔬菜地,分别于1986年9月12日和11月6日进行2次土样采集。采土深度均为5～10厘米,每一地取土样约2000克。

植物种子分泌物对腐霉和苗期病害的影响

研究９种植物种子分泌物对终极腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ）和刺腐霉（Ｐ．ｓｐｉｎｏｓｕｍ）菌丝生长及卵孢子形成的影响，及其与苗期病害发生关素的结果，这二种腐霉在含不同植物种子分泌物的培养条件下菌丝生长速度、生长量和卵孢子的形成数量有较大差异，其中腐霉菌丝生长速度和生长量与出苗数呈显著的负相关，而与猝倒苗数关系不密切；腐霉卵孢子的形成数量与苗期病害无相关性。

石刁柏茎枯病的研究概况及存在的问题

石刁柏茎枯病是一种世界性分布的重要病害之一，在我国的各石刁柏产区均有不同程度的流行与为害。近年来，众多学者对其作了大量的研究，本文对该病害的病原、发病规律及其防治技术作了较系统的综述，并对存在的问题作了初步探讨。

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T-DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体:A1-412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1-412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1-412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern杂交显示A1-412基因组中T-DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1-412突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。

绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其毛壳菌转化

利用PCR方法从Trichoderma viride的基因组DNA中克隆了一个42kDa的内切几丁质酶基因,扩增的长度为1672bp,其中包含了启动子和mRNA的编码区。将该基因与来自构巢曲霉的色氨酸启动子相连后,通过原生质体转化将该基因导入球壳毛壳菌CG10。内切几丁质酶活性的测定结果表明,约1/3转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高。本实验为利用基因工程方法提高毛壳菌的生防能力打下了较好的基础。

在水稻纹枯病菌菌核形成中5个基因的表达差异分析

以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)菌株GD118不同生长时期的总RNA为材料,以18SrRNA作为内参基因,根据实验室抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)已获得的立枯丝核菌基因片段的表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)设计引物,采用实时定量RT-PCR检测A、B、C、E、F基因(分别为双组分反应调节子、激活巨噬细胞糖蛋白、胞外金属弹力蛋白酶、亲环蛋白、内质网囊泡蛋白ERV29)的表达,以期找到水稻纹枯病菌菌核形成中的差异表达基因。结果表明:从菌核开始形成到菌核成熟的过程中,这5个基因的表达量逐渐降低,且菌核在成熟时表达量最低,但成熟后这些基因的表达量迅速恢复到之前的水平,之后表达量基本保持不变。提示这5个基因在水稻纹枯病菌菌核形成的不同时期的表达有显著差异,说明这5个基因可能受菌核形成过程中胁迫条件的诱导表达。

CryK13V基因对绿色木霉原生质体的转化

将Cry基因的13位赖氨酸（K）突变成缬氨酸（V）的突变基因CryK13V，构建于pCSN43载体。完成绿色木霉转化载体pCSNTCCm的构建．在研究绿色木霉（Trichoderma viride）原生质体形成和再生基础上，初步研究了绿色木霉转化条件．结果表明，绿色木霉原生质体形成的合适条件为：pH6．98磷酸盐缓冲液加入4mg·mL^-1 glucanex。培养24h的菌丝，40r·min^-1振荡条件下30℃酶解4h，原生质体产量达到4．7×10^7个·mg^-1．原生质体在0．3mol·L^-1肌醇和0．3mol·L^-1。KCl的CM培养基上再生率为14．5％．用限制酶XhoⅠ介导将带有潮霉素抗性标记的CryK13V基因转化到绿色木霉中。转化率为每微克DNA得到1～2个转化子，转化子稳定性和PCR鉴定结果表明，外源基因已转入受体菌绿色木霉中．

蚕豆种质资源对赤斑病的抗性鉴定与筛选

鉴定与筛选来自国内外938份蚕豆种质对赤斑病(Botrytis fabae Sard.)的抗性,结果表明:中抗品种96份,占总数10.23％;中感品种386份,占41.15％;感病品种295份,占31.45％;高感品种161份,占17.16％.中抗品种来自蚕豆赤斑病常年发生严重的浙江、湖南、江苏、湖北等省.品种抗性类型与该病引起产量损失、粒色和粒型大小的关系分析显示,中抗品种在该病流行年份,不施药防治也能保持较稳定的产量,说明能基本控制该病流行为害;中抗品种的籽粒以中粒型为主,仅有极少数材料为大粒型,而且其粒色以绿色为主,乳白色和浅绿色有一定比例.

江西省水稻种质资源对纹枯病的抗性评价

利用C30、、E67、GD118、YN7和YN3等5个水稻纹枯病鉴别菌株在苗期对322份江西水稻种质资源对纹枯病抗性进行接种鉴定。结果表明,对5个鉴别菌株均表现高抗或抗病的有兴国寸谷糯、南城麻壳红、湘矮早10号、二禾红、小站红米稻、47601(韩国)和晚油红8个品种,平均病级分别为2.34、1.97、2.46、1.73、2.04、1.89、2.46和2.53,系统观察还发现G珍籼97B、湘恢91269与Rocca 3个品种比对照高感品种Lemont更感病。本文对国内水稻纹枯病鉴别体系中鉴别菌株和鉴别品种的选择进行了讨论。